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第一部分 细胞实验--重组慢病毒LV-Endostatin-GFP载体的建立及体外转染内皮祖细胞实验目的内皮抑素(Endostatin,ES)是作用最强的抑制血管生长的因子之一,不影响正常组织周围的血管,而且无毒性和耐药性,增加内源性ES的表达可能成为抑制视网膜新生血管化的一种治疗措施。而同时基于移植健康的EPC已成为了治疗视网膜新生血管疾病的新途径,本研究旨在体外实验构建ES高表达内皮祖细胞株,检测ES高表达对VEGF表达的影响和EPC细胞功能的影响,为动物实验做准备。材料与方法大鼠心脏采血,用密度梯度离心法获取单个核细胞,并将细胞接种于纤维蛋白包被过的培养皿中,常规培养于内皮祖细胞专用培养基(EGM-2-MV)中。分别利用流式细胞术及免疫荧光法鉴定内皮祖细胞。用PCR方法得到Endostatin序列片段,将Endostatin基因插入含绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体质粒(LV5-EF1a-GFP+PURO),通过三个辅助质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5),采用脂质体 Lipofectamine 2000介导的脂质体转染方法共转染人胚肾HEK293T细胞,获得重组慢病毒(LV-Endostatin-GFP),感染大鼠EPC,使得基因整合入EPC中并持续表达,然后采用最佳筛选浓度的嘌呤霉素溶液进行筛选,以获得稳定转染Endostatin基因的EPC细胞株。通过实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法和蛋白质印迹法(Western blot)验证Endostatin在EPC细胞的表达。同时测定Endostatin转染对于VEGF表达的变化。检测内皮祖细胞转染前后的细胞活性(增殖能力、迁移率、分化能力、凋亡和细胞周期)。结果构建重组慢病毒载体(LV-Endostatin-GFP),转染内皮祖细胞后,利用最佳筛选浓度的嘌呤霉素(1μg/ml,4天),成功构建携带内皮抑素基因的内皮祖细胞稳转株。qRT-PCR和Western blot试验显示Endostatin在EPC细胞中表达明显增高(P<0.001),但VEGF的表达水平明显下降(p<0.05)。内皮祖细胞转染前后细胞的活性检测发现Endostatin高表达可抑制细胞活性,与阴性对照组相比,Endostatin高表达内皮祖细胞增殖率明显下降(P<0.001),迁移率明显下降(O<0.01)和分化能力明显下降(P<0.001),凋亡率明显增高(P<0.001);流式细胞仪检测Endostatin高表达后细胞分裂停留在G1期明显增多(P<0.001),而S和G2期细胞则显著减少(P<0.001),细胞生长明显受到抑制。而阴性对照组细胞活性未见明显影响。结论EPC细胞可以被携带内皮抑素基因的慢病毒载体(LV-Endostatin-GFP)转染并高表达内皮抑素,VEGF的分泌显著减少,同时Endostatin高表达可促使EPC凋亡,降低EPC的增殖、迁移及分化能力,细胞生长受到抑制,从而降低细胞活性。而阴性对照组细胞活性没有受到影响,说明转染过程本身没有对细胞的活性造成影响。转染了内皮抑素基因的EPC细胞可能通过分泌内皮抑素发挥细胞内的直接及旁分泌作用(抑制VEGF的分泌),从而抑制血管生成的作用。但体外实验结果须动物实验加以验证。第二部分 动物实验——玻璃体腔注射携带Endostatin基因EPC抑制大鼠视网膜新生血管生成的实验研究实验目的本研究以慢病毒-内皮抑素(LV-ES)体外转染外周血EPC后的细胞(ES-EPCs)移植入大鼠视网膜新生血管模型,探讨EPC导向的内皮抑素基因抑制视网膜新生血管生成的可行性和有效性,为抑制视网膜新生血管疾病血管生成的基因治疗提供依据。材料与方法新生7d(P7)的SD大鼠分为两大组:一组暴露于70%高氧环境5天,另一组为正常环境空白对照。分别于鼠龄P14,P15,P17,P19时用眼底血管造影(FFA)观察视网膜新生血管形成,确定氧诱导的的视网膜病变(OIR)模型的构建。又将模型大鼠随机分为四组,于出生后第14天(P14)四组大鼠经玻璃体腔注入相同体积的质粒或细胞(分别为空载LV,LV-ES,EPC以及LV-ES-EPC)。并设置同龄幼鼠置空白对照组。每组选3只大鼠,于注射后第1h、1d、3d、5d进行活体FFA的检测,比较各组新生血管的渗漏面积(于检测当日注射荧光素钠),于注射后5 d进行活体FFA检测后处死,取右眼进行组织切片,利用苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin,HE)染色法,观察并计数突破视网膜内界膜的视网膜新生血管内皮细胞核数。并通过免疫组化方法(ICC)检测视网膜新生血管组织的Endostatin、VEGF、CD31 及 CD133 的表达。结果FFA检查发现,实验组荧光素明显渗漏,对照组未见荧光渗漏,说明视网膜新生血管形成,OIR模型成功建立.FFA结果显示:注射LV-ES(OIR+ESOE)组:与空白对照组比,荧光渗漏每个时间点都没有显著性差异,说明新生血管被显著抑制;与NC组(注射空载LV)比,荧光渗漏在第3天(P<0.01)和第5天(P<0.001)显著减少,说明OIR+ES OE组显著抑制新生血管。注射EPC(OIR+EPCs)组:与空白对照比,每个时间点,荧光渗漏增加(P<0.05);与NC比,每个时间点没有统计学差异;与OIR+ESOE组比,1天(P<0.05),3天(P<0.01),5天(P<0.001)荧光渗漏均增加,说明OIR+EPCs组确实没有抑制新生血管的作用,但不会促进血管渗漏及新生血管形成。注射LV-ES-EPC(OIR+ES-EPCs)组:与空白对照组比,每个时间点荧光渗漏都没有显著性差异,说明新生血管被显著抑制;与NC比,第5天时荧光渗漏显著减少(P<0.001);与OIR+ESOE组比,每个时间点荧光渗漏均无显著性差异,说明OIR+EPCs组有与OIR+ESOE 一样的抑制新生血管的作用;与OIR+EPCs组比,1天(P<0.05),3天(P<0.01),5天(P<0.001)荧光渗漏均显著减少,说明OIR+ES-EPCs组有明显抑制新生血管的作用。HE结果:空白对照组,视网膜新生血管较少;与空白对照组比,OIR+NC和OIR+EPCs组血管内皮细胞核明显增多(P<0.01),说明新生血管显著增多,与NC比,OIR+ES-OE和OIR+ES-EPCs组血管内皮细胞核显著减少(P<0.05),说明新生血管显著减少;与OIR+ESOE组比,OIR+EPCs组血管内皮细胞核明显增多(P<0.05),说明新生血管显著减少;与OIR+EPCs组比,OIR+ES-EPCs组血管内皮细胞核明显减少(P<0.01),说明新生血管显著减少。ICC结果显示:Endostatin的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC组表达减少(P<0.05);与 NC 比,OIR+ES-OE 和 OIR+ES-EPCs 组表达增多(P<0.01);与 OIR+ES OE 组比,OIR+EPCs 组表达减少(P<0.05);与 OIR+EPCs 组比,OIR+ES-EPCs 组表达增多(P<0.05)。VEGF的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC组表达增多(P<0.05);与NC比,OIR+ES-OE,OIR+EPCs 和 OIR+ES-EPCs 组表达没有显著差异;OIR+ES-OE,OIR+EPCs和OIR+ES-EPCs三组也没有显著性差异。CD31的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC和OIR+EPCs组表达增多(P<0.05);与 NC 比,OIR+ES-OE 组表达减少(P<0.05);与 OIR+ES-OE 组比,OIR+EPCs组表达显著增多(P<0.05);但和OIR+EPCs组比,OIR+ES-EPCs组表达没有显著差异。CD133的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC,OIR+EPCs组和OIR+ES-EPCs组表达减少(P<0.05);与NC比,OIR+ES-OE组表达增加(P<0.05);与OIR+ES-OE组比,OIR+EPCs 和 OIR+ES-EPCs 组表达显著减少(P<0.05);但和 OIR+EPCs组比,OIR+ES-EPCs组表达没有显著差异。结论FFA法,HE染色和ICC法的联合研究证实,Endostatin基因转染的EPC可明显抑制视网膜新生血管生成,单纯的EPC不会促进新生血管的形成,为视网膜新生血管疾病新治疗方向提供依据。