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本文分析了KDM5C基因shRNA重组慢病毒载体的构建及其对肝癌HepG2细胞的增殖和迁移的影响。本研究分为两个部分： 第一部分：KDM5C基因shRNA重组慢病毒载体的构建及其对肝癌HepG2细胞的增殖和迁移的影响。 目的： 制备干扰KDM5C基因重组慢病毒载体，观察干扰人KDM5C基因后对肝癌HepG2细胞增殖、迁移及长链非编码RNA GAS5表达的影响。 方法： ⑴设计3对针对KDM5C基因短发夹型RNA干扰序列(short hairpin RNA，shRNA)和1对阴性对照序列，退火后连接到pLKD载体上，经转化PCR阳性克隆筛选及测序鉴定。使用四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒，慢病毒包装后进行滴度测定。⑵将Lv-shKDM5C慢病毒感染HepG2细胞，qRT-PCR和Western blotting检测HepG2细胞KDM5C的mRNA和蛋白表达。⑶MTT法检测转染Lv-shKDM5C后细胞增殖能力。⑷细胞划痕实验检测转染Lv-shKDM5C后细胞迁移能力。⑸qRT-PCR法检测HepG2细胞中lncRNA GAS5 mRNA的表达水平。 结果： ①PCR扩增和测序结果表明：成功构建Lv-shKDM5C慢病毒载体。经包装产生的三组慢病毒载体滴度: Lv-shKDM5C-1是4.95×108IU/ml；Lv-shKDM5C-2是3.46×108 IU/ml；Lv-shKDM5C-3是3.08×108IU/ml。②qRT-PCR和Western blotting检测结果表明：与正常肝细胞相比，肝癌HepG2细胞KDM5C表达明显增加。与未转染组及阴性对照组相比，三组Lv-shKDM5C病毒感染 HepG2细胞后 KDM5C的 mRNA及蛋白表达量均显著下降(p<0.05)；其中Lv-shKDM5C-3组下降最为明显(p<0.05)，因此选取Lv-shKDM5C-3进行后续实验。③MTT结果表明：Lv-shKDM5C-3转染肝癌HepG2细胞后48h和72 h细胞生长增殖均受到抑制(p<0.05)。④细胞划痕实验结果表明：Lv-shKDM5C-3转染肝癌HepG2细胞48h后细胞迁移率明显降低(p<0.05)。⑤qRT-PCR结果表明：HepG2细胞干扰KDM5C后lncRNA GAS5 mRNA表达显著升高(p<0.05)。 结论： 成功构建了特异性沉默人KDM5C基因的shRNA慢病毒载体；将其转染肝癌HepG2后可有效抑制细胞增殖和迁移；我们首次发现干扰 KDM5C还可增加长链非编码 RNA GAS5的表达。 第二部分：过表达MEG3慢病毒载体的构建及MEG3稳定过表达HepG2/EC109细胞系的建立。 目的： 构建母系表达基因（MEG3）的慢病毒载体，建立MEG3稳定过表达的人肝癌HepG2和食管癌EC109细胞系。 方法： ⑴采用EcoRI/BamHI内切酶及无缝克隆酶将合成好的人MEG3的CDS区连接到慢病毒载体（pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS, Lv-NC），重组质粒双酶切及测序鉴定。⑵使用四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒，慢病毒包装后进行滴度测定。⑶获得的慢病毒毒液分别感染人HepG2和 EC109细胞系并通过嘌呤霉素筛选阳性表达细胞，用倒置荧光显微镜及实时荧光定量PCR检测转染效率。 结果： ①EcoRI/BamHI限制性内切酶 PCR电泳条带位置正确；重组慢病毒载体测序包含MEG3的CDS区且序列正确。②包装后重组慢病毒表达载体Lv-MEG3的滴度是1.66E+08 IU/ml。③倒置荧光显微镜观察结果显示：经过2μg/ml嘌呤霉素筛选后，HepG2和 EC109细胞中的Lv-MEG3组的绿色荧光率均达100％。④实时荧光定量 PCR结果显示，与对照组(Lv-NC）比较，稳转 Lv-MEG3慢病毒表达载体组的HepG2和 EC109细胞MEG3表达水平均明显升高（p<0.01）。 结论： 成功构建了MEG3慢病毒表达载体及MEG3稳定过表达的HepG2和EC109细胞系。