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背景与目的:上皮间质化(Epithelial mesenchymal transition EMT)是指指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。目前已发现EMT存在于多种上皮来源的肿瘤中,如乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌等。胶质瘤发生于神经外胚叶组织,属神经上皮肿瘤,是人神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤。恶性胶质瘤在肿瘤形成的早期即向周围正常脑组织浸润,是胶质瘤恶性进展和术后复发的重要原因。因此,研究恶性胶质瘤上皮间质化,对于有效逆转胶质瘤恶性进展和降低术后复发有着非常重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,1ncRNA)是一类长度大于200核苷酸的非编码RNA。近年来许多研究发现1ncRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关,且这些1ncRNA参与肿瘤的发生、生长、浸润和复发等过程。在本研究中,我们分析发现,长链非编码RNAH19在胶质瘤组织和细胞中高表达,且相对于H19低表达的患者,H19高表达的患者往往预后不良。在人胶质瘤细胞LN229中过表达H19可以促进胶质瘤细胞的侵袭、迁移、胶质瘤干细胞球形成和诱导EMT的发生;在胶质瘤细胞系U87和U251中,敲低H19可以抑制胶质瘤细胞的侵袭、迁移、胶质瘤干细胞球形成和EMT的进程。此外,在裸鼠的原位成瘤实验发现,敲低H19可以抑制裸鼠胶质瘤的生长。进一步,我们发现,H19可能是通过竞争性结合miR-130a-3p,从而调控SOX4的表达,影响EMT进程。本研究发现,H19在胶质瘤组织中的表达随着病理级别的升高而升高。胶质瘤中高表达H19的往往提示预后不良;H19是一个新的EMT调控因子,H19通过内源性竞争miR-130a-3p调控SOX4从而影响EMT进程。研究方法:一、H19的表达谱数据分析①H19在低级别胶质瘤(LGG)和高级别胶质瘤(HGG)中的表达检测:利用多中心临床样本数据库,中国胶质瘤基因数据库(CGGA),美国癌症基因信息的数据库(TCGA),美国脑肿瘤分子数据库(REMBRANDT)以及NCBI的高通量基因表达数据库(GEO)中的GSE16011和GSE4290表达谱芯片分析H19在胶质瘤中的表达情况及对预后的影响。②H19在20例临床胶质瘤组织样本中的表达检测:利用qRT-PCR技术,在20例临床胶质瘤组织样本中检测H19的表达情况。③H19在胶质瘤细胞系中的表达检测:利用qRT-PCR技术,在多种胶质瘤系中检测H19的表达情况。二、H19影响胶质瘤细胞的侵袭迁移能力和EMT的进程H19表达水平的变化对胶质瘤细胞侵袭迁移能力和EMT的进程影响的检测:在H19低表达的胶质瘤细胞系LN229中转染H19-Overexpression慢病毒和在H19高表达的胶质瘤细胞系U87和U251中转染H19-Knockdown慢病毒后,利用Transwell,划痕实验,qRT-PCR和Western-blot检测H19表达水平的变化对胶质瘤细胞侵袭迁移能力和EMT的进程影响。三、H19对胶质瘤干细胞自我更新的影响H19表达水平的变化对胶质瘤干细胞自我更新能力的影响:在U87胶质瘤细胞来源的胶质瘤干细胞(GSC)中,分别转染H19-Overexpression和H19-Knockdown慢病毒后,利用显微镜观察GSC肿瘤球数目和直径变化。四、裸鼠原位成瘤实验检测敲低H19对胶质瘤生长的影响在体内,通过裸鼠颅内原位成瘤实验检测,H19表达水平的变化对胶质瘤细胞生长能力的影响:利用小动物活体成像动态观察,接种sh-H19和negative control组胶质瘤的生长情况。五、H19调控EMT的分子机制①H19和SOX4相关性研究:首先,我们通过临床胶质瘤数据库(CGGA、TCGA、REMBRANDT和GSE16011)分析了 SOX4在胶质瘤中的表达情况;其次,我们分析了 H19和SOX4的表达相关性。②H19和SOX4都是miR-130a-3p的靶基因:我们通过生物信息学分析了 H19、SOX4和miR-130a-3p的靶向关系;其次,利用双荧光素酶报告基因实验验证H19、SOX4和miR-130a-3p的靶向关系;最后,利用Western-blot技术,验证miR-130a-3p对SOX4蛋白的影响。③H19通过吸附miR-130a-3p从而调控SOX4的表达:在U87和U251细胞中,敲低H19的表达对SOX4mRNA和蛋白水平的影响;在293T细胞中,利用共转实验研究,过表达H19对SOX4的luciferase的影响;利用RNA免疫共沉淀(RIP)研究,过表达H19对miRNA富集作用的影响。研究结果:一、H19在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中高表达①通过胶质瘤数据库(CGGA、TCGA、REMBRANDT、GSE16011和GSE4290)分析发现,相比低级别胶质瘤,H19在高级别胶质瘤(HGG)表达谱数据中高表达。②进一步利用胶质瘤数据库KM分析发现在高级别胶质瘤(HGG)中,高表达H19提示预后不良。③H19在恶性胶质瘤组织和细胞系中高表达二、H19促进胶质瘤细胞侵袭迁移能力和EMT进程在体外细胞学实验中,外源过表达H19促进胶质瘤细胞侵袭、迁移和诱导人胶质瘤细胞发生EMT,敲低H19可以抑制人胶质瘤细胞胶质瘤细胞侵袭、迁移和EMT进程三、H19促进胶质瘤干细胞自我更新能力在胶质瘤干细胞中,外源性过表达H19可以促进胶质瘤干细胞成球能力,下调H19可以抑制胶质瘤干细胞成球,而且形成的肿瘤球形态不规则。四、在裸鼠原位成瘤实验中敲低H19抑制胶质瘤的生长在体内原位成瘤实验中,相比于对照组,敲低H19组颅内肿瘤生长减慢,体积减小。五、H19内源性竞争miR-130a-3p调节SOX4调控EMT进程①H19和转录因子SOX4表达正相关:胶质瘤数据库分析发现,SOX4在恶性肿瘤高表达,且表达与H19正相关。②H19和SOX4都是miR-130a-3p的靶基因:通过生物信息学分析、双荧光素酶报告基因和Western-blot实验技术发现miR-130a-3p能同时靶向H19和SOX4。③H19内源性竞争miR-130a-3p调节SOX4:双荧光素酶报告基因和RNA免疫共沉淀实验发现H19内源性竞争miR-130a-3p调节SOX4.④H19调控SOX4的表达:在U87和U251细胞中,敲低H19的表达可以抑制SOX4 mRNA和蛋白的表达水平。结论:①H19在胶质瘤组织和细胞高表达。在胶质瘤中高表达的H19提示预后不良。②H19/miR-130a-3p/SOX4在调控胶质瘤EMT进程中发挥着重要的作用,该信号通路的发现证实了 lncRNA-miRNA-mRNA的RNA调控模式的存在,为胶质瘤的研究提供了一个新思路。