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黄瓜花叶病毒(CucumberMosaicVirus,CMV)是严重危害农作物的病毒之一。番茄花叶病毒(Tomatomosaicvirus,ToMV)常常与此种病毒复合侵染加工番茄，引起加工番茄条斑坏死病毒病。近年来加工番茄病毒病在新疆发生越来越严重，严重影响了加工番茄的品质和产量，造成较大的经济损失。对此，如何控制加工番茄上病毒病的发生与危害是当前生产上迫切需要解决的问题。 一直以来，抗病毒病育种都是消除植物病毒病威胁的主要策略，但传统的育种方法具有艰苦费时等局限性，从而限制了育种工作更快更深入地发展。近20年来植物抗病毒基因工程的技术路线已日趋成熟，尤其近年来，RNAi技术的出现为植物抗病毒育种提供了一条新的途径。 本研究采用RNAi技术，降解靶基因mRNA，抑制CMV和ToMV内源靶基因的表达，从而达到双抗CMV和ToMV的目的。 第一步，构建双抗CMV和ToMV的植物表达载体： 1.CMV干扰片段的RT-PCR扩增：根据CMVNS0-4分离物设计合成特异性引物（在上游引物引入BamHⅠ酶切位点，在下游引物引入KpnⅠ酶切位点），以CMVNS0-4为模板，分别扩增出CMVMP和复制酶蛋白部分基因序列，记为CR4、CR9、CR12、CR14，将扩增片段克隆到pGEM-Teasy，获得重组克隆pGEM-T-CR。 2.ToMV干扰片段的RT-PCR扩增：根据ToMVSCS-2分离物设计合成特异性引物（在上游引物引入SacⅠ和BamHⅠ酶切位点，在下游引物引入BglⅡ酶切位点），以ToMVSCS-2为模板，分别扩增出ToMV复制酶编的蛋白部分基因序列，记为To4、To9、To12、To14，将扩增片段克隆到pGEM-Teasy，获得重组克隆pGEM-T-To。 3.两干扰片段的融合：用BamHⅠ/PstⅠ从重组载体pGEM-T-CR切下CR片段，插入用BglⅡ/PstⅠ酶切的pGEM-T-To，即构成重组质粒pGEM-T-TC4、pGEM-T-TC9、pGEM-T-TC12和pGEM-T-TC14。 4.中间载体的构建：分别用BamHⅠ/KpnⅠ和SacⅠ/SpeⅠ酶切重组质粒pGEM-T-TC，获得正、反向To-CR片段，定向插入piRDG12Intron的两侧，从而构建成反向重复的中间载体piRTC4、piRTC9、piRTC12和piRTC14。 5.用XbaI/EcoRI从中间载体上切下反向重复的片段，插入用同样酶切的植物表达载体pBi35SG12上，酶切鉴定结果表明，成功构建了植物表达载体pBi35STC4、pBi35STC9、pBi35STC12和pBi35STC14。 第二步，烟草的遗传转化： 将四个重组质粒通过电击的方法导入根癌农杆菌GV3101中，利用农杆菌介导法转化本氏烟，经50mg/L卡那霉素筛选及PCR检测，结果表明成功获得了转基因烟草植株。经进步攻毒试验及RT-PCR检测可知，结果表明pBi35STC12和pBi35STC14转基因烟草抗病毒效果较好，所以，在这4个片段中，TC12和TC14是最好的RNAi干扰片段。为最终双抗CMV和ToMV转基因加工番茄的获得提供了可能。