背景：骨缺损、骨折延迟愈合或不愈合是各种骨科手术中经常遇到的难题,解决办法通常是进行骨移植。当前骨缺损的治疗策略仍然是选用大量的骨移植材料填充修复,良好的骨诱导作用、骨传导作用、骨生成作用通常被认为是理想的移植骨或骨替代物应具备3种基本作用。手术治疗中常选择的骨填充材料有自体骨、同种异体骨、异种骨和人工骨等几种。自体骨移植仍然是骨缺损修复重建治疗的“金标准”,因为自体骨组织相容性好,不存在免疫反应；而且具有成骨能力强,有利于骨缺损早期修复的优点。然而,自体骨取材有限,取骨量很难满足大范围骨缺损治疗的需求,且取骨区常遗留疼痛、血肿、感染等并发症,一旦出现并发症,将给患者本人及家属增加额外的痛苦及负担。20世纪90年代,有学者率先将应用于牙科的膜引导性组织再生技术(MGTR)[3]应用于骨修复治疗当中来。MGTR所使用的生物膜具有良好的组织相容性,能够有效减少免疫反应；生物膜结构致密,能限制其他非成骨相关细胞(如成纤维细胞、炎症细胞等)长入骨修复区,从而为成骨细胞的分化、增殖提供一个良好的引导空间,以便骨缺损愈合的顺利完成。但是,应用膜引导技术修复骨缺损有严格的适应症,要求骨缺损断端基本整齐,骨缺损周围软组织损伤较轻,以便保证骨缺损周围有良好的成骨微环境。对于缺损段较大,周围组织损伤严重,缺损段骨组织严重不规则的骨缺损来说,不适合使用该技术。亦有学者尝试使用带血管的自体骨移植,比如有学者选用带血管蒂的腓骨和骼骨瓣整体作为移植块,虽然报道的效果较一般自体骨移植好,但相关的并发症较普通自体骨移植更多且严重,不仅取骨区手术切口更大,取材量及部位亦更加有限,且取骨形状难以与缺损段匹配、造成取骨浪费等缺点。异体骨作为自体骨的替代物,避免了自体骨来源有限的缺点,种类可大概分为同种异体骨和异种骨。为了实际应用,不同的异体骨移植材料来源不同,相对应的制备方法也不同。但异体骨自身抗原仍然难以彻底消除,研究表明异体骨诱导成骨的能力与免疫排斥反应密切相关,免疫排斥反应越严重,诱导成骨的能力就越弱。对于大段骨缺损的治疗如果单纯选择同种异体骨移植,宿主新生骨爬行替代非常缓慢,因此,在修复过程中可能由于异体骨的吸收造成力学强度的下降,加上大段移植物经获取和加工等处理后常存留自身不能修复的微小损伤等原因,骨缺损修复过程中会出现骨不愈合、再发骨折等并发症。选择同种异体骨作为骨填充材料治疗大段骨缺损,影响骨缺损愈合的因素有很多,因此,为了保证愈合过程顺利完成,需要对供者因素严格的筛选(患有传染病、血液病及肿瘤的宿主不能作为供体)；异体骨的保存与制备要遵循严格的条件；移植时异体骨体积要严格评估及选择(移植体积越小,成骨效果越好)等等。为了克服自体骨与同种异体骨在骨缺损修复方面存在的问题,组织工程技术不断探索改进。近年来组织工程技术应用在大段骨缺损修复方面显现了优势,尤其是组织工程支架在大段骨缺损修复方面作用明显。最早使用的金属支架虽然能够提供较强的力学支持,但是金属离子的释放会影响骨修复愈合的过程,而且对于术后的影像学检查影响较大。相对于金属支架而言,人工合成材料显现了明显的优势。早期的人工合成骨填充材料只是基于材料本身的组织相容性用于单纯的结构填充。然而,材料本身并不能降解,也不具有促进成骨的作用,因此,虽然完成了结构填充,但也阻碍了新生骨的生成,从而不利于骨修复。随着材料工程研究的不断深入,一些具有生物活性并且可以被宿主逐渐降解吸收的填充材料被合成出来。这些材料大大促进了骨组织的再生修复,但是,填充材料降解特性难以把握,降解太快有导致再次骨折的可能,降解太慢又不利于新生骨的修复。因此,为了更快、更好的完成缺损段骨的修复,材料工程研究方面的科学家利用填充材料的多孔性,复合一些公认的可以促进成骨的生长因子(如骨生成蛋白BMP)、药物、骨髓间充质干细胞等等,取得了革命性的进步[们。材料的孔隙及降解效率可人为控制,辅以促进成骨的因素,这样便大大提高了骨缺损修复的效率。理论上实现了骨填充材料与宿主快速整合,早期达到合适的应力支撑,从而缩短了愈合时间的优点。良好的骨移植材料应该同时具备力学支撑及诱导成骨的能力。虽然组织工程支架发展了有近20年的时间,从合成工艺与应用方面经历了数次革新性的进步,现有的支架仍然面临一些问题,如降解效率难以精确控制,促进成骨的活性因子剂量难以把握(剂量太大有可能导致异位骨化,剂量太小成骨作用不明显)等等。已知羟基磷灰石(HA)是骨组织主要的无机成分,针状和柱状的羟基磷灰石晶体构成了骨的纳米结构的基本单元。卷曲和相互缠结的磷灰石晶体分布在胶原分子间的间隙区,共同组成了骨在纳米尺寸上的功能单元,束状结构和团聚结构能保证骨承受高强度而不变形,而卷曲和疏状交织结构有利于传递营养物,同时又赋予了骨良好的韧性。柠檬酸(CA)本身就是骨组织的固有成分,占骨组织成分的5%,而且是人机体三羧酸循环的重要代谢通路,同时具有良好的生物相容性、亲水性、无细胞毒性、并且能够促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化。已经有研究表明创新性的将羟基磷灰石和柠檬酸复合制成接近于生物体骨质的有机成分和无机成分的骨填充材料,具有非常好的生物相容性,可能是一种理想的骨组织替代材料。美国宾夕法尼亚大学材料与生物技术研究室杨建教授利用柠檬酸、纳米羟基磷灰石按一定比例复合,制成一种新型的复合骨修复材料。研究表明,基于柠檬酸可降解的POC-Click-HA材料不仅具有骨传导性,而且可能在骨诱导有一定作用。本实验采用体外细胞和基于柠檬酸可降解的POC-Click-HA材料进行共培养实验研究,从而明确基于柠檬酸的羟基磷灰石可降解材料对骨髓间充质干细胞的毒性、生物学表达的影响以及用于组织工程骨支架材料的可行性,同时,通过手术将该支架置于兔桡骨缺损模型中以评估其促进骨缺损愈合修复的效果。本课题基于传统四肢大段骨缺损行植骨修复时,需要良好的力学上的支撑,又要有一定的诱导成骨的能力,将可降解材料(基于柠檬酸可降解的POC-Click-HA材料)制成与兔子桡骨形状相近的单相管状支架,同时也基于仿生学原理制成与骨干结构相近的双相支架。将支架植入兔桡骨大段骨缺损模型中,从而评价该支架在修复骨缺损方面的作用。为临床提供一种理想的骨填充材料提供理论依据。研究中我们还进行了一些关于柠檬酸在促进成骨方面的细胞学研究,包括支架复合细胞的组织相容性研究及柠檬酸促进成骨的分子机制研究。目的：可降解的含柠檬酸的新型POC-Click-HA骨填充材料,除了具有高HA结合率外,还可通过设定孔隙率来调节其刚度,根据仿生学原理制作成单相和双相支架(单相支架：65%质量分数的羟基磷灰石,65%的孔隙率；双相支架：65%质量分数的羟基磷灰石,外相50%的孔隙率,内相70%的孔隙率。长度均为1cm,单相支架直径3mm,双相支架外径3mm,内径1mm)。本研究中,我们将单相和双相支架应用于兔桡骨大段骨缺损模型中,通过对骨缺损愈合修复的评价从而评估基于柠檬酸可降解的POC-Click-HA材料在促进成骨方面的作用,并且对比单、双相的自降解POC-Click-HA支架修复大段骨缺损的效果。方法：使用60只新西兰大白兔,常规手术暴露右侧桡骨,制作稳定的桡骨大段骨缺损模型(长度10mm),随机分为4组(n=15),单相材料组兔接受全层孔隙率70%的单相骨材料填充术,双相材料组兔接受双相(外层孔隙率24%,内层70%)骨材料填充术,阴性Control组兔术中未予干预,阳性Control组兔术中骨缺损用自体骨填充,所有实验兔术后均行石膏过关节外固定。分别在术后5周、10周、15周行X线检查,随后处死兔子,取标本进行micro-CT扫描、生物力学和组织学检测。结果：影像学检查结果示实验组：术后5周两组实验组均可见到支架与骨缺损断端吻合良好,成骨明显,已有部分连续性骨痂通过,新生骨包绕支架周径约40%；其中,双相支架纵切面可见支架内相有降解,且有新生骨长入。术后10周两组实验组可见纵行骨痂进一步生长,有大量新生骨沿支架表面生成,新生骨包绕支架周径约70%;术后15周两组实验组均可见到骨痂已基本全部包绕支架,可观察到完全连续性骨痂形成,骨干光滑。阴性control组：术后5周可见骨缺损区仍明显,骨断端髓腔封闭,断端区增粗明显,虽有纵向新生骨痂但量较少；术后10周仍可见骨缺损仍未修复,断端进一步增粗,骨质变硬,髓腔完全封闭,纵向骨痂未见明显生长。术后15周虽然可以观察到骨缺损长度较前两个时间点变短,但骨缺损仍未完全修复。断端骨痂较前两个时间点增多,骨硬化更加明显。阳性control组：术后5周见自体骨回植位置良好,未见移位,骨缺损处有骨痂形成,但骨折线仍明显。术后10周可见自体骨回植位置良好,未见移位,骨折线已模糊,骨折处膨大,修复良好。术后15周可见骨缺损处愈合良好,已经看不出骨折线,髓腔也基本再通,骨修复重塑基本完成。micro-CT扫描后骨分析结果及生物力学结果均显示双相材料组骨缺损愈合优于单相材料组(P<0.05),在5周时,生物力学测试结果显示双相材料组优于自体骨组(P<0.05)。两实验组骨修复情况明显优于阴性对照组(P<0.05),与自体骨比较在15周时差异无统计学意义(P<0.05)。组织学检测结果在微观方面支持上述结果。结论：新型基于柠檬酸可降解POC-Click-HA支架,组织相容性好,骨传导佳,是良好的大段骨缺损修补材料。从单、双相支架对于骨缺损修复的结果分析来看,双相支架在修复大段骨缺方面明显优于单相支架。双相支架除了具有良好的骨传导性外,外层致密的结构可以阻止纤维组织长入,同时提供了合适的刚度,从而保证早期生物力学的回复及骨修复的顺利完成。因此,本研究为骨填充材料结构方面的调整提供理论依据。