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杂种优势的利用是提高作物单位面积产量的有效途径。玉米(ZeamaysL.)是世界上最早利用杂种优势的作物之一。利用不育系进行杂交制种可以免去人工去雄，降低了劳动成本、提高种子纯度，在杂种优势的利用中具有明显的优越性。为了更好地发挥玉米不育系在杂种优势利用中的作用，在理论上阐明细胞质雄性不育(CMS)和育性恢复机理具有重要的理论意义，同时在核质互作分子机理的研究领域中，CMS已成为重要的模式性状。玉米CMS-S系的育性由线粒体上嵌合基因orf355/orf77和核基因(Rf3/rf3)共同决定。虽然orf355/orf77已被克隆，并对其影响细胞质和核基因的表达进行许多研究，但核育性基因Rf3/rf3的克隆，表达产物的鉴定、与线粒体基因和其他核基因互作关系的阐明等仍有待继续深入的研究。本研究以Rf3/rf3近等基因系S-MO17Rf3Rf3/S-MO17rf3rf3为材料，利用cDNAmicroarray和抑制性扣除杂交(SSH)技术，在转录水平上对玉米CMS-S核恢复基因进行功能基因组学研究，得到以下初步结果：
1、在玉米S-Mo17Rf3Rf3生长的不同时期，分别提取不同组织的mRNA，构建了玉米幼芽(含胚芽鞘)、三叶期幼苗(含根系)、淹水处理后的三叶期幼苗(含根系)、六叶期整株(含根系)、拔节期茎间居间生长组织、花药、授粉5天后的雌穗和开花期成熟叶共8个cDNA文库；等量混合各文库的质粒DNA，采用基因组DNA饱和杂交法进行均一化处理，构建了一个含6×104个克隆的均一化cDNA文库(MONL)。该文库的插入片段在0.4kb～4.0kb之间，平均长度为1.18kb;71％的序列为uniqueESTs，12％以上的插入片段为现有核酸数据库中所没有同源序列的新序列，76％的插入序列为未知功能序列。cDNA克隆代表了多个组织和发育时期的RNA，且代表高丰度表达基因的cDNA克隆所占比例低，平均每个持家基因在文库中的频率约为0.4％，能在均一化文库中检测到低丰度表达基因的cDNA克隆。
2、将MONL文库中的cDNA插入片段进行PCR扩增，通过Agarose胶电泳检测，将扩增质量较好的10830个克隆的PCR产物，点制在尼龙膜上，制作cDNAmicroarray。使用5个组织的mRNA混合样与cDNAmicroarray进行重复杂交实验，检测芯片质量，结果表明，重复实验的芯片间各对应点的信号强度和芯片内两重复点的信号强度的重复性较好，R2分别为0.9728和0.965。
3、采用不连续蔗糖密度梯度离心，将不同发育状态的小孢子和花粉分为没有形成液泡的小孢子(Y)，已形成多个小液泡的小孢子(SV)、形成了大液泡的小孢子(LV)和淀粉充实或败育程度不同的花粉(SF1～SF3/CP1～CP3)。分别将3种发育状态(SV、LV、SF1/CP1)的S-(Rf3)和S-(rf3)花粉mRNA反转录后与cDNAmicroarray杂交，结果显示，(1)SV、LV和SF与cDNAmicroarray杂交的阳性克隆数分别为7611、7494和7105个。小液泡期的基因表达数目要比大液泡和花粉充实期的基因表达数目要多(117个和506个)，大液泡发育期的基因表达数目比花粉充实时期的多(392个)，基因表达的数目从小液泡期到花粉充实期呈现逐步减少的趋势，这一结果与不同发育时期小孢子和花粉内实际的生理生化状况相一致。(2)大液泡与花粉充实初期之间的基因表达差异最大，398个克隆存在4倍以上差异，占大约3.7％；大液泡期与小液泡期间，4倍以上差异表达的克隆有115个，占1.06％。(3)S-(Rf3)和S-(rf3)间，166个克隆代表127个基因表现出4倍以上的差异。127个基因按功能可分为：花粉发育相关基因19个，占15％左右；信号转导相关基因16个，占约13％；代谢相关基因19个，约占15％；与蛋白质的合成和降解相关的基因16个，占13％；转录相关基因6个，占5％；物质转运相关基因5个，占4％；细胞防御和细胞凋亡相关基因9个，占7％；未知功能的序列27条，约占20％，其中新发现的序列10条，约占8％。
4、SSH分析发现了67个在S-(Rf3)和S-(rf3)间差异表达的克隆，这些差异克隆代表13个基因，其中有3个基因(PG、expansin和allergen)与Microarray杂交结果相同。这些差异基因主要参与信号传导、膜系统形成、花粉的成熟以及抗细胞衰老等生理活动，但没有发现参与糖代谢、淀粉合成及其转运相关基因。
5、4个抑制细胞凋亡基因(cystatin、Vdac2、BI-1和14-3-3)和2个细胞凋亡相关基因(Translationallycontrolledtumorprotein-likeprotein和leaf-senescence-relatedprotein)及Ca2+信号和G蛋白信号传导相关基因在S-(Rf3)和S-(rf3)间的表达表现出显著差异。Northernblot的结果与芯片杂交的结果基本一致，并且cystatin、Vdac2、BI-1和14-3-3等具有时空特异性表达特性。花药和花粉的DNA电泳证实，与S-(Rf3Rf3)比较，S-(rf3rf3)花药组织中DNA提前出现DNA片段化，并且，S-(rf3)花粉中也存在以寡聚核糖体为单位的DNA片段化。在CMS-S花粉中，线粒体上的呼吸链相关基因如CoxⅡ、Cytochromec1、ATPsynthaseβ-subunit和Inorganicpyrophosphatase以及与H+传递相关基因Thioredoxinm2和Dihydroflavanoidreductase等异常表达，导致呼吸链中断和线粒体功能异常。
6、比较基因组方法将15个感兴趣的玉米ESTs和基因序列中的6个被定位在玉米第二染色体上，这6个基因分别为PP2C、CDPK、CDPK-relatedproteinkinase、Tim9、S-AdoMetDC和Translationallycontrolledtumorprotein-likeprotein；另外，CDPK、CDPK-relatedproteinkinase、Tim9和Translationallycontrolledtumorprotein-likeprotein的DNA序列被定位在2.09bin，并且Translationallycontrolledtumorprotein-likeprotein、Tim9和CDPK的DNA序列定位在与Rf3紧密连锁标记umc1525的两侧。
7、综合以上分析结果，初步认为S-(rf3)花粉中，orf355/orf77的表达，作为一种PCD信号，诱导与呼吸链相关基因的异常表达，S-(，rf3)花粉细胞的呼吸链无法实现正常功能，花粉细胞能量亏缺，最终导致线粒体结构和功能的异常，进而激发由线粒体介导的细胞凋亡。Rf3的作用机理可能是通过Ca2+信号途径和小G蛋白介导的信号途径，调节细胞核和细胞质基因(包括抑制细胞凋亡基因)转录本的积累，使得花粉正常发育途径得以进行，从而恢复花粉育性。
克隆玉米对低氧胁迫早期响应基因并研究其功能是本研究所关注的另一领域。渍害是南方玉米生产的重要制约因子，淹水对玉米伤害的实质是厌氧胁迫。玉米在厌氧胁迫过程中，早期响应基因的表达对后期厌氧多肽(ANPs)的表达起着重要的调控作用，并直接影响着玉米对厌氧胁迫的代谢和形态适应。因此，克隆玉米对低氧胁迫早期响应基因并研究其功能，是当前玉米抗逆性遗传研究的重要课题。本研究对淹水胁迫2h后玉米根系中基因表达谱进行了研究，结果发现，151个克隆在对照与处理间存在2倍以上差异，其中，由于淹水处理而下调表达的克隆有37个，上调表达的有114个；32个克隆在对照与处理间存在3倍以上表达差异。这32个克隆代表24个非冗余基因，其主要功能涉及到信号传导、糖酵解、脂代谢、能量代谢、转录和蛋白质合成等过程。另外，发现了3个新的受淹水诱导表达cDNA片段，并提交到了DNADataBase(CF569035～CF569037)。通过RACE扩增，得到了1条玉米类锌指蛋白(ZmZF)的全长cDNA(AY515607)。Northern分析也证明该基因在淹水处理的玉米根系被高效诱导表达。生物信息学分析说明该基因所编码的蛋白可能参与蛋白质合成的起始。综合分析在淹水胁迫后SKP1/ASK1-likeprotein、20Sproteasomessubunita-3和ZmZF的增强表达，初步认为翻译水平上的调控在玉米根系对淹水胁迫的早期响应中起着重要的作用。