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马立克氏病(MD)是由马立克氏病病毒引起的一种淋巴增生性肿瘤疾病，是危害养禽业最为严重的疾病之一。自从上个世纪70年代，该病可以通过接种致弱的毒株或天然不致瘤株进行防治。但是，MDV的毒力不断演化，呈不断增强的趋势，上个世纪90年代早期，分离到了vv+MDV，该毒株使得当今任何的单价苗都不能产生很好的保护，因此，新型MD疫苗的开发迫在眉睫。在新型MD疫苗的开发的过程中，利用MDV CVI988株为载体的研究成为热点。但是，以此为载体的新型MD疫苗的开发受到许多因素的影响，其中最关键的因素是疫苗的稳定性和疫苗的免疫保护力。本文的目的是通过用于重组病毒构建的启动子的筛选、融合蛋白基因的合成以及同源重组臂的稳定性分析，构建用于MD防治的基因工程疫苗；通过免疫保护试验来评价疫苗的好坏，以期望构建具有自主知识产权的疫苗，同时为新型MD疫苗的开发奠定基础。本文的研究内容主要从以下几个方面展开： 1．马立克氏病病毒CVI988株病毒囊膜糖蛋白B启动子的克隆及特性研究 为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达，以改善马立克氏病毒为载体的重组病毒的免疫保护力，克隆了马立克氏病病毒(MDV)CVI988株病毒囊膜糖蛋白B(gB)启动子，通过测序发现克隆的gB启动子与GenBank上发表的MDV GA株序列的同源性为99.5％。以E.coli lacZ基因为报告基因，构建pSK-gB-LacZ真核表达载体。将pSK-gB-LacZ瞬时转染中国地鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)细胞，染色后，出现蓝色，说明所克隆的gB启动子可以有效地调控lacZ基因的转录；将gB-LacZ基因表达盒插入到MDV转移载体pUS10中，构建重组转移载体pUS-gB-LacZ，将该转移载体转染已感染MDV CVI988株的次代CEF，利用蓝白斑进行重组病毒的筛选，然后对筛选到的重组病毒进行生长曲线测定。结果表明亲本病毒与重组病毒的生长曲线一致，说明gB-LacZ基因表达盒的插入不影响病毒的稳定性，为下一步MDV gB启动子的应用奠定基础。 2．用于重组马立克氏病病毒(MDV)的适宜启动子的筛选