背景与目的结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一,占所有癌症发病率超过9%的比例,居世界恶性肿瘤发病第三位和致死原因第三位。2015年,美国直肠癌和结肠癌的新发病例约为132,700,死亡数为49,700;世界范围内,每年大约850,000人发病,500,000死于该病。我国结直肠癌的2005年结直肠癌死亡率比1991年增加70.7%,年均增加4.71%,2009年结直肠癌发病数和死亡数分别达38.3万和17.5万,已超过美国。随着生活水平的提高和饮食结构的改变,中国城市结肠癌的发病率呈逐年上升趋势。结直肠癌早期以手术治疗为首选,但早期症状不突出,待患者确诊时已属中晚期。因此,化疗和药物治疗为结肠癌患者延长生命、提高生活质量发挥着重要作用。目前癌症常用药物,尽管有不同的靶位性和作用机制,但经临床反复用药,肿瘤细胞普遍出现耐药性。所以,对新型、低毒、高效、价廉的药物的研发是十分必要的。在现今结肠癌患病率逐年增高的情形下,研究一种能够抵抗耐药性并诱导结肠癌死亡的药物,阐释其作用机制具有重要的科学价值和临床意义。沙蟾毒精(Arenobufagin)是从蟾酥中提取的一种蟾毒内酯类化合物。研究表明沙蟾毒精可靶向PI3K/Akt/mTOR调控肝癌细胞自噬和凋亡的相互作用,具有抑制肝癌HepG2细胞黏附、迁移和侵袭的作用。沙蟾毒精可抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖,抑制鸡胚尿囊膜血管新生,提示其具有血管生成抑制作用。沙蟾毒精对结肠癌的作用及其诱导结肠癌细胞死亡机制尚不明确。鉴于此,本课题对沙蟾毒精诱导结直肠癌细胞凋亡及其调控机制进行研究。Drp1可通过PGAM5诱导其脱磷酸,从而调节线粒体分裂。研究表明抑制细胞因子信号6可促使PGAM5和Drp1复合物形成,降低Drp1磷酸化,增加其诱导的线粒体断裂,可促进细胞凋亡,增加Bax构象改变以及靶向线粒体和寡聚化。本研究旨在研究沙蟾毒精对结肠癌的作用,阐明沙蟾毒精通过Bax-PGAM5L-Drp1复合物的形成诱导结肠癌发生内源性凋亡的机制。应用HCT-116 WT(野生型)细胞和 HCT-116 Bax-/-细胞,以及 PGAM5 的 3’-PGAM5L和PGAM5S的siRNA或慢病毒转染(shRNA),观察沙蟾毒精对结肠癌细胞作用的变化。通过免疫共沉淀反应,确认PGAM5L-Bax-Drp1之间的相互作用。在体外和体内试验中,我们分别应用十字孢碱(staurosporine)与顺铂,进一步证实Bax-PGAM5L-Drp1复合物在内源性凋亡的重要作用。阐释沙蟾毒精诱导结肠癌发生凋亡的分子作用机制,为沙蟾毒精治疗结肠癌的临床治疗,提供位点指向。方法1.沙蟾毒精对不同干预后结肠癌细胞活力的影响选用SW480、DLD1、LS174T三种结肠癌细胞和HCT116(WT)和HCT116(Bax-/-)细胞,37℃ 5%C02培养。收集对数期细胞,调整细胞密度约10000/孔(96孔板)。待细胞贴壁后,分别加入不同干预和浓度梯度的沙蟾毒精,每孔100μl。每个浓度设5个复孔,同时设立空白对照组,给药后分别培养后,每孔中加入5mg/mLMTT20μl,继续培养4h。弃旧液,每孔加入150μnl二甲基亚砜,置摇床振荡1Omin,至紫色结晶完全溶解。酶联免疫检测仪OD=490nm处测量吸光值。细胞生存率=试验组吸光度值/对照组吸光度值。实验重复3次后,统计分析。2.Hoechst 33342/PI染色观察沙蟾毒精作用结肠癌细胞后细胞核形态学变化细胞培养铺板方法见方法1,待细胞贴壁后,分别加入浓度梯度沙蟾毒精,每孔100μL。每个浓度设3个复孔,同时设立空白对照组,给药后分别培养。用PBS将20 mg/ml Hoechst 33342储存液制备成5-10μg/ml工作液。贴壁细胞弃培养基,用PBS清洗1-2次。每孔加入35μlHoechst 33342工作液,置于37 ℃温育 15-20 min。弃 Hoechst 33342 染液,PBS 洗涤 1-2 次,加入 50μg/ml 的 PI工作液,用荧光显微镜拍照分析统计。实验重复三次。3.PE-Annexin V-FITC/7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡率结肠癌细胞以1×105/孔接种于6孔板中,待细胞贴壁后,分别加入不同干预和浓度梯度的沙蟾毒精,每孔2ml。设立空白对照组,给药后分别培养后,按照流式试剂盒说明书进行,采用美国Beckman公司EPICS XL分析型流式细胞仪进样测定,根据PE-AnnexinV-FITC(X)/7-AAD(Y轴)荧光做对数散点图,可获得由4个象限组成的双参数图:左上象限(K1)为细胞收集过程中产生的损伤细胞,右上象限(K2)为晚期凋亡细胞和坏死细胞,左下象限(K3)为活细胞,右下象限(K4)为早期凋亡细胞,每个象限的细胞数即为受检总细胞数中所占的比例。实验重复3次。4.Western blot 法分析不同干预后对 PARP、caspase-3\7\9、PGAM5、Drp1、Bax等蛋白表达的影响结肠癌细胞以1× 105/孔接种于6孔板中,待细胞贴壁后,分别加入不同干预和浓度梯度的沙蟾毒精,每孔2m1。设立空白对照组,给药后分别培养后,Bradford法蛋白定量后,每组取约80μg蛋白样品,加入5倍上样缓冲液后进行12%SDS-PAGE,将湿转法转印至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1h。一抗4℃孵育过夜。HRP偶联的相应二抗(1:1000稀释)室温孵育1h。然后利用 KODAK Image Station 4000MM Digital Imaging System 进行化学发光法检测。5.细胞免疫荧光技术验证差异蛋白的表达细胞分别加入不同干预和浓度梯度的沙蟾毒精,和溶剂对照组,干预24h后,通过免疫荧光双染观察差异蛋白在线粒体的表达及在细胞内的表达及易位情况。6.慢病毒感染技术观察干扰差异蛋白基因表达后结肠癌细胞的生长情况将差异蛋白基因shRNA通过慢病毒感染到结肠癌细胞,观察稳定转染shRNA对结肠癌细胞生长的影响。7.JC-1法检测细胞线粒体膜电位培养基重悬细胞,经0.5 ml JC-1工作液染色后,加入250 μl 1X缓冲液,经FACSCalibur流式细胞仪检测,用CellQuest软件分析荧光相对强度,观察细胞线粒体膜电位的变化8.线粒体形态分析(Micro-P)将培养于共聚焦皿的细胞,PBS洗三遍,Mito-trackerGreen染线粒体30分钟,用激光共聚焦拍摄图片,Micro-P软件分析图片。按面积,轴向,和长度/宽度,分析个体线粒体分裂,并分为五个类型:小碎片线粒体(1型,蓝色),大碎片的线粒体(类型2,黄色),直管线粒体(3型,绿色),曲形小管线粒体(4型,橙),和马蹄、甜甜圈或网络管形线粒体(5型,紫色)。9.透射电镜观察细胞的超微结构收集细胞,1000rpm离心5分钟,4℃PBS重悬,2000rpm离心5分钟,沉淀用2.5%的戊二醛溶液4℃固定过夜,倒掉固定液,用0.1 M pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,包埋好的样品。样品在超薄切片机中70～90nm切片,该切片经柠檬酸铅溶液、醋酸双氧铀和50%乙醇饱和溶液各染色15 min,透射电镜下观察。10.CO-IP检测Bax、PGAM5和Drp1蛋白结合情况细胞用沙蟾毒精作用24h后,提取细胞总蛋白(300μLRIPA裂解液/皿),空白组和加药组各取20μL冻存,作为western blot对照分析。剩余裂解液加入1μg一抗抗体,4℃ 360°摇床旋转过夜。第二日,加入45μL的protein A beads,4℃ 360°摇床旋转2-4h。4℃ 2500rpm离心15min,吸弃上清,用裂解液将beads清洗3-4遍,每次离心后弃上清。最后加入2xloadingbuffer上样缓冲液,98℃金属浴8-9min,取上清进行western-blot分析。11.EGFP-SW480细胞裸鼠原位癌造模及Arenobufagin作用观察根据文献方法建立EGFP-SW480细胞裸鼠原位结直肠癌动物模型。Arenobufagin按3mg/kg/d和6mg/kg/d灌胃,瘤体可于成像系统观察到开始给药。接种42天后将成像观察到原位实体瘤30只裸鼠随机分为三组,每组10只,两组芹菜素干预组,一组溶剂对照组。实验前记录裸鼠体重及应用活体成像系统观察瘤体。12.HCT116(WT)和 HCT116(Bax-/-)细胞裸鼠异位瘤造模及 Arenobufagin作用观察肿瘤细胞皮下接种24h后,将小鼠称重并随机分为6组,HCT116(WT):空白对照组(只给予含1%DMSO的PBS)、1mg/kg顺铂组和Arenobufagin 3mg/kg组,HCT116(Bax-/-)细胞分组同上。每日腹腔给药一次,连续14天。末次给药后次口,称体重、处死小鼠,剥离瘤块。实验前记录裸鼠体重。13.统计方法采用SPSS 13.0统计软件进行分析,结果表示为:均数±标准差(x±SD)。两组间比较采用独立样本t检验。多组间比较采用OneWay-ANOVA,方差齐采用LSD法,方差不齐采用Welch法校正,两两比较采用DunnettT3法;P<0.05表示具有统计学意义。结果1.Arenobufagin诱导结肠癌细胞发生凋亡。Arenobufagin呈剂量和时间依赖性的降低CRC细胞活力(P值均小于0.01)。Arenobufagin作用于结肠癌细胞后,出现染色质凝聚,细胞膜成皱缩,核固缩和核碎裂,以及磷脂酰丝氨酸外翻等凋亡的形态学特征。证实了 Arenobufagin诱导SW480和DLD-1的细胞死亡可归类为细胞凋亡。同时Arenobufagin可降低细胞线粒体膜电位。caspase-9、PARP出现片段化,活化的caspase-9激活caspase-3,使其出现片段化。同时线粒体蛋白中Bcl-2表达随Arenobufagin给药浓度增加而减低,Bax表达增加。Z-VAD-FMK预处理细胞,可抑制Arenobufagin诱导的凋亡,提高其细胞活力(t=-14.59,P<0.001)和降低凋亡率(t=16.00,P<0.001)。这表明 Arenobufagin 诱导的细胞死亡是caspase依赖的细胞凋亡。2.Arenobufagin诱导结肠癌细胞凋亡主要是由Bax介导的线粒体内源性凋亡。Arenobufagin诱发细胞中Bax在线粒体中的易位和积累,并以剂量依赖的方式形成了二聚体。与HCT116(Bax-/-)细胞比较,Arenobufagin以剂量依赖的方式显著降低HCT116(WT)细胞生存率(P值均小于0.01),增加细胞凋亡率(P值均小于0.01),HCT116(WT)有PARP和caspase 9的降解片段化,伴有Bax蛋白的激活。与HCT116(Bax--A)细胞比较,Arenobufagin促进HCT116(WT)细胞中cyto C的从线粒体释放到胞浆,AIF从线粒体到核的转位,Bax聚集在线粒体上。因此,本研究中Arenobufagin引起cyto C和AIF从线粒体的释放表明,Arenobufagin不仅对线粒体膜有强烈的通透作用,同时也有破坏线粒体膜的完整性的效果。3.PGAM5L参与Bax介导的内源性细胞凋亡。PGAM5L-KD,而非PGAM5S-KD可抑制Arenobufagin对SW480和HCT116(WT)细胞的影响,提高其生存率(SW480:1μM:P<0.001,5μ]M:P=0.001;HCT116(WT):1μ1M:P<0.001;5μM:P<0.001)和降低凋亡率(SW480:P<0.001;HCT116:P=0.001),而对 Arenobufagin干预的 HCT116(Bax-/-)细胞无影响。PGAM5L siRNA,而非 PGAM5S siRNA 可抑钳jArenobufagin诱导的Bax蛋白在SW480细胞线粒体中的移位和表达。PA:RP蛋白的降解片段化也由PGAM5L-KD,而非PGAM5S-KD所抑制。因此PGAM5L参与Arenobufagin诱导通过Bax蛋白易位至线粒体介导的内源性凋亡。4.Drp1参与Bax介导的内源性细胞凋亡。Drp1 siRNA或Drp1抑制剂MDIVI-1能显著抑制Arenobufagin对SW480和HCT116(WT)细胞的影响,提高存活率(SW480:F=22.16,P=0.002;HCT116:F=24.07,P=0.017)和降低凋亡率(SW480:F=19.13,P=0.020;HCT116:F=10.27,P=0.012)。Arenobufagin 可降低细胞中Drp1的表达并激活Bax蛋白,以上蛋白表达变化可被PGAM5L-KD抑制,而非PGAM5S-KD。而且无论是Drp1siRNA或Drp1抑制剂MDIVI-1,都对 Arenobufagin 干预的 HCT116(Bax-/-)细胞活力无影响(1μM:F=2.68,P=0.147;5μM:F=1.63,P=0.273)。同时 Arenobufagin 诱导 Bax蛋白在线粒体的积累受到Drp1 siRNA或MDIVI-1的抑制。因此Drp1是PGAM5L与Bax激活介导内源性凋亡的不可分割的合作伙伴。PGAM5L siRNA能减少Arenobufagin诱导的小碎片线粒体数量的增加(P=0.005<0.01),而非PGAM5SsiRNA(P=0.180)。Drp1 siRNA和MDIVI-1使正常线粒体的比例显著增高(F=10.44,P=0.003;其中 Drp1 siRNA:P=0.003;MDIVI-1:P=0.003),减少大碎片线粒体数量(F=7.58,P=0.009;其中Drp1 siRNA:P=0.01;MDIVI-1:P=0.008),以上结果表明,PGAM5L、Drp1与线粒体分裂的发生密切相关。5.Bax-PGAM5L-Drp1相互作用参与结肠癌细胞内源性凋亡。随Arenobufagin或十字孢碱作用于SW480细胞的时间延长,PGAM5抗体可将Drp1和Bax成功沉淀下来,Drp1抗体也可将PGAM5和Bax成功沉淀下来,因此其可诱导PGAM5与Drpl、Bax形成转录复合体。pcDNA3.1/myc-HA-Bax真核质粒转染HCT116(Bax-/-),HCT116(WT)给予 iMAC2 20μmol/L 预处理细胞 3h,HCT116(Bax-/-)+ HA-Bax细胞中PGAM5抗体可以将Drp1和Bax成功沉淀下来,而在HCT116(WT)+iMAC2细胞中PGAM5抗体不能将Drp1沉淀下来。在HCT116(Bax-/-)细胞中PGAM5与Drp1无相互作用,这可以通过Bax基B转染所改变。NC-KD 组、PGAM5S-KD 组和 PGAM5-KD+HA-PGAM5L 组细胞中PGAM5抗体可以将Bax成功沉淀下来,而在PGAM5-KD、PGAM5L-KD组和PGAM5-KD+HA-PGAM5S组细胞中PGAM5抗体不能将Bax沉淀下来,说明PGAM5L-KD显著抑制Drp1和Bax之间的相互作用。随Arenobufagin作用时间延长,PGAM5抗体将p-Drp1沉淀的结合蛋白量较空白组降低。而在HCT116(Bax-/-)细胞中随Arenobufagin作用时间延长,PGAM5抗体将p-Drp1沉淀的结合蛋白量较空白组未发生明显变化。这说明Drp1去磷酸化在Bax-PGAM5相互作用诱导细胞凋亡中发挥了重要作用。在Arenobufagin和十字孢碱诱导的细胞凋亡中,Bax是PGAM5-Drp1相互作用所固有必需的。6.动物研究。建立EGFP-SW480细胞裸鼠原位癌模型,Arenobufagin通过诱导Bax蛋白介导的细胞凋亡抑制CRC的生长和转移。运用HCT116(WT)和HCT116(Bax-/-)细胞建立裸鼠异位瘤模型。给予Arenobufagin或顺铂后,在Arenobufagin组中,HCT116(WT)细胞模型裸鼠肿瘤重量和体积均低于HCT116(Bax-/-)组(weight:t=-4.10,P=0.006;volume:t=-11.07,P<0.001)。在顺铂组中,HCT116(WT)细胞模型裸鼠肿瘤重量和体积均低于HCT116(Bax-/-)细胞模型组(weight:t=-3.06,P=0.022;volume:t=-3.53,P=0.033)。Arenobufagin 和顺铂抑制CRC的生长和转移是以Bax蛋白依赖性方式与Bax-PGAM5L-Drp1复合物的形成相关。结论Arenobufagin通过Bax-PGAM5L-Drp1复合物介导内源性凋亡,抑制结肠直癌的生长和转移。