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背景和目的:流行病学资料表明,目前临床使用的局部麻醉药均具有潜在的神经毒性。自噬(autophagy)是一种进化高度保守的分解代谢过程,负责降解发育过程中不再需要的、或应激状态下变性或有害的蛋白质和细胞器。证据表明,因细胞种类、应激因素的不同,自噬可以抑制细胞死亡、也可以引起细胞死亡。然而,局部麻醉药对神经细胞自噬过程的影响,以及自噬在局部麻醉药神经毒性中的作用尚不清楚。本课题将探讨自噬在局部麻醉药神经毒性中的作用及其机制,以期为控制局部麻醉药潜在神经毒性提供新的思路和基础数据。方法:我们用酯类局麻药(丁卡因、普鲁卡因)和酰胺类局麻药(布比卡因、利多卡因和罗哌卡因)刺激体外培养的人神经细胞母细胞瘤细胞SH-SY5Y,构建局部麻醉药神经毒性的体外培养模型,然后进行下列分析。[1]细胞存活率(MTT法检测)。[2]细胞形态学(光学显微镜)。[3]自噬标志物LC3-II产生、p62降解及信号通路蛋白表达量(Western Blot法检测)。[4]自噬抑制性信号m TOR/p70S6K活性(Western Blot法检测)。[5]抑制自噬(通过si RNA敲降Beclin-1)。[6]抑制自噬对局部麻醉药所致细胞死亡的影响。[7]抑制自噬对局部麻醉药所致细胞形态学损伤的影响。结果:[1]局部麻醉药呈浓度依赖性降低细胞存活率。[2]局部麻醉药引起严重的细胞形态学异常。[3]局部麻药升高LC3-II水平,降低p62水平,提示自噬流量(autophagic flux)升高。[4]m TOR和p70S6K信号活性在局部麻醉药刺激后下降,提示局部麻醉药通过抑制蛋白表达水平降低m TOR/p70S6K信号而激活自噬反应。[5]Beclin-1敲降(knockdown)后,局部麻醉药所刺激的细胞中LC3-II水平降低,而p62增加,提示Beclin-1敲降有效地逆转了局部麻醉所增加的自噬。[6]通过Beclin-1敲降抑制自噬后,进一步降低局部麻醉药引起的细胞死亡。[7]通过Beclin-1敲降抑制自噬后,进一步加重局部麻醉药引起的细胞形态学异常。结论:酯类局麻药(丁卡因、普鲁卡因)和酰胺类局麻药(布比卡因、利多卡因和罗哌卡因)均呈浓度依赖性损伤神经细胞,同时增加自噬流量、抑制m TOR/p70S6K信号通路。由于m TOR/p70S6K是自噬的抑制性信号,提示局部麻醉药通过抑制m TOR/p70S6K信号而激活自噬。而通过Beclin-1敲降阻断自噬反应后,增加了局部麻醉药对SH-SY5Y神经细胞的损伤作用。这些数据提示,自噬是不同局部麻醉药所致神经毒性过程中所共有的一种保护性反应,增加自噬作用有望控制局部麻醉药神经损伤的风险。