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目的通过增殖型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者组织标本以及体外建立的人视网膜血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cell,HRCECs)在高糖、高糖联合VEGF刺激的细胞模型,逐步探讨CKAP2在PDR模型中的表达情况及其对视网膜血管内皮细胞生物学行为的影响,CKAP2与VEGF的相互作用关系以及CKAP2与p53的相互作用关系,以期初步明确CKAP2参与PDR的分子机制,为PDR的治疗提供新的思路和科学依据。方法1.从无伴视网膜病变的2型糖尿病(T2DM)患者(DM组)、非增生性糖尿病视网膜病变患者(NPDR组)、增殖性视网膜病变患者(PDR组)或年龄、性别、民族匹配的健康人(CON组)共收集36份血样本。分别收集外周血单个核细胞和单核细胞,采用Western blot和q PCR实验分别检测CKAP2和p53的蛋白和m RNA水平。从进行玻璃体切除术的PDR患者(PDR组)和特发性黄斑前膜患者的视网膜前膜患者(IMEM组)收集眼内组织。进行手术时,每组收集9份未稀释的玻璃体样本和3份增殖膜或前膜样本,采用q PCR和组织免疫荧光实验用以检测CKAP2、p53的m RNA和蛋白表达。2.内皮细胞培养基加高糖(30 m M D-葡萄糖,HG组)或人内皮细胞培养基加高糖和VEGF(30 m M D-葡萄糖+30 ng/ml VEGF,VEGF+HG组)培养的HRCECs作为实验组,正常的人内皮细胞培养基加甘露醇(8.3 m M D-葡萄糖+21.7+m M D-甘露醇,HM组)或人内皮细胞培养基加VEGF(8.3 m M D-葡萄糖+30 ng/ml VEGF,VEGF组)作为对照组,分别采用MTT、细胞划痕和内皮细胞管腔形成实验检测细胞的生物学行为。采用Western blot和q PCR实验检测CKAP2蛋白及m RNA表达情况。在HG或/和VEGF组加入CKAP2 RNAi阻断其表达,并检测细胞生物学行为。3.在HG或/和VEGF培养组中,将106μg/ml浓度的Lucentis加入细胞中阻断VEGF,并采用Western blot技术检测CKAP2蛋白表达水平。进一步采用MTT、细胞划痕和内皮细胞管腔形成实验比较阻断CKAP2和VEGF对细胞生物学行为的改变。4.体外阻断p53和CKAP2,观察二者蛋白的表达水平以明确p53与CKAP2的相互作用关系,并阐明CKAP2参与PDR发生的作用机制。结果1.在人外周血和玻璃体液标本中,PDR组的CKAP2蛋白和m RNA表达较其他组显著增高。高糖或高糖联合VEGF培养的内皮细胞增殖、迁移和血管形成能力增强,阻断CKAP2后,HRCECs的增殖、迁移和血管形成能力明显减弱。(P<0.05)。2.雷珠单抗阻断VEGF后会引起CKAP2蛋白的下调。阻断CKAP2和VEGF均能引起HRCECs的增殖、迁移和血管形成能力减弱,但是阻断CKAP2引起细胞增殖和迁移能力减弱程度更明显。3.在外周血及玻璃体液标本中,PDR患者的p53 m RNA表达较其他组显著增高,高糖或高糖联合VEGF刺激HRCECs能引起p53蛋白的明显上调。相对于IMEM患者的视网膜前膜,p53和CKAP2的共定位染色在PDR患者的视网膜增殖膜表现出明显的强荧光共定位。在HRCECs中阻断p53后,VEGF或者高糖+VEGF组的CKAP2蛋白表达下调,阻断CKAP2后未观察到p53蛋白的下调。结论1.高表达的CKAP2通过影响视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力参与PDR的发生发展;2.CKAP2在参与PDR进展过程中可能受到VEGF的不完全调控;3.CKAP2在参与PDR进展过程中具有比VEGF更强的促进视网膜血管内皮细胞增殖和迁移的能力;4.CKAP2在参与PDR发生过程中同时受p53信号通路的调控。