背景和目的新生儿脑出血是新生儿主要的脑损伤形式之一,表现为新生儿生发基质出血(Germinal Matrix Hemorrhage,GMH),主要由新生儿脑生发基质层血管内皮结构发育不全、外力作用,如产道压力等,诱导血管破裂出血所至。由于近年来围产技术以及重症监护技术的提高,越来越多的GMH早产儿得以存活,可能伴有严重的神经功能障碍,如脑积水(hydrocephalus),脑萎缩(cerebral atrophy)、脑瘫(cerebral palsy)以及炎症灶机化形成癫痫灶等。GMH及其神经后遗症所带来的社会—经济压力备受关注,因此探讨GMH病理生理特点、研究药物干预靶点具有重大临床意义。GMH的严重程度主要与胚胎期时间长短相关,文献报道称在37周胚胎期出生的新生儿中有15%是未成熟的,其中有50%早产儿会在胚胎第24周至胚胎第30周诱发GMH。从病理角度出发,基质层(Germinal Matrix,GM)是神经元前体细胞分化为神经元及部分胶质细胞所在地,也是GMH出血部位易发点。GM层在胚胎期为凝胶状,富含细胞及血管且该处毛细血管床的胶原蛋白层和基底膜层没有紧密连接蛋白和胶质细胞足突包被。大量细胞处于分裂期,代谢旺盛、耗氧量大,微血管增加是必然的,在血流量极大而血管骨架结构不完整的情况下,血管破裂出血就会发生,该理论是公认的GMH发病原因。由于GM临近室管膜下区,严重时血肿自会突破GM层进入脑室内形成GMH,是否破入脑室已成为目前GMH分级的重要标准,I级破入脑室10%、II级破入脑室50%,III级破入脑室50%且伴有脑室扩张,IV级伴有严重的梗阻性脑积水。John Z等在2012年首次报道了通过立体定位在新生第7天(p7)大鼠微量注入Ⅶ型胶原酶,破坏微血管外基膜引起出血,很好的模拟GMH后脑积水、神经功能障碍的后遗症,目前被广泛用于GMH的药物靶点研究。神经炎症(neuroinflammation)是神经系统病理状态下先天性免疫即炎症应答,是机体自主防御修复机制启动的结果。然而研究表明,过度的炎症反应将释放大量的炎症损伤因子,在继发性脑损伤中扮演重要角色。脑出血后血液成分流出脉管,红细胞裂解并释放血红蛋白、凝血酶以及含铁血黄素等活性成分,激活中枢神经系统固有免疫细胞-小胶质细胞。小胶质细胞占中枢神经系胶质细胞的20-25%,是调控出血性脑卒中后继发炎症损伤的关键细胞,具有细胞形态动态变化特点,根据细胞周围环境变化,并调控周围神经细胞凋亡、分化、增殖等。既往研究证实小胶质细胞可被分为M0、M1、M2三种形态,其中M0是小胶质细胞静止状态,实时监控颅内细胞或微环境并作出相应变化;M1是激活后小胶质细胞,阿米巴状,表现为颅内巨噬细胞,具备识别、趋化、吞噬等效应,在血液成分溢出脉管后,大量M0小胶质细胞触发并激活为M1型,在趋化因子等参与下游走到异物(溢出成分)处,进行吞噬、消化,在后期释放大量消化产物如肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL-6)等,甚至自身裂解成为异物,主要参与细胞毒作用。研究报道M2型小胶质细胞亦是活性状态的一种,在生理状态下,参与神经纤维束的修剪,维护神经纤维连接的有序性;病理状态下可能参与受损神经纤维连接、与神经细胞相互作用,促进神经元前体细胞增殖、分化、迁移等再生过程。据此,出血性脑卒中后小胶质细胞形态变化的研究颇具科学价值,然而小胶质细胞形态转化的调控机制仍不清楚,新生儿脑出血是作为研究小胶质细胞形态转化与神经纤维束以及神经元相互作用病理过程的最佳选择。内源性大麻素系统(endocannabinoid system,ECS)是机体广泛存在的配体-受体系统,参与某些生理、病理反应,如能量消耗、心血管疾病、肿瘤以及神经退行性疾病等。ECS的内源性配体主要有anandamide(Narachidonoylethanolamine,AEA)以及2-arachidonoylglycerol(2-AG)两种。根据机体需要,AEA和2-AG可由细胞膜上花生四烯酸合成,与细胞膜上两种不同的G蛋白偶联受体(Cannabinoid Receptor1/2,CB1/2)直接结合,发挥效应。CB1R与成瘾性密切相关,其研究多集中于神经退行性疾病如老年痴呆、创伤后遗症以及阿尔兹海默症等;CB2R的发现较晚于CB1R,被认为是神经系统病理状态下参与细胞调控的主要膜受体。大量研究证实CB2R参与神经系统炎症发应,认为小胶质细胞上CB2R的表达能有效减轻神经炎症介导的脑损伤,但具体机制及调控靶点仍不清楚。结合前期工作基础,本研究使用Ⅶ型胶原酶诱导p7新生大鼠脑出血,模拟临床上新生儿脑出血(GMH)的病理生理特点,并通过影像学、行为学以及细胞生物学表现;针对GMH后脑小胶质细胞的形态转化以及相应生物学特点,以内源性大麻素受体(CB2R)作为干预靶点,探讨CB2R激活调控小胶质细胞表型转换以及与神经细胞相互作用的细胞、分子机制。1,为出血性脑卒中继发神经炎症的调控提供新靶点;2,为GMH及其后遗症的临床救治提供新思路;3,为防治GMH后神经炎症,改善预后提供新手段。第一部分Ⅱ型大麻素受体(CB2R)在新生儿脑出血后米诺环素介导的神经保护效应中的作用及机制研究目的该部分研究为阐明米诺环素在新生儿GMH中的神经保护效应及其抗炎机制是否通过激活内源性CB2R实现。材料与方法研究采用Ⅶ型胶原酶(0.3U)立体定向微量注射入p7幼鼠右侧生发基质层构建新生儿脑出血模型。通过腹腔注射米诺环素(45mg/kg)及选择性CB2R抑制剂(AM630,1mg/kg)或选择性激动剂(JWH133,1.5mg/kg)及相应安慰剂组干预共198只幼鼠,使用免疫组织化学、免疫印迹技术以及ELISA技术等检测内源性CB2R、小胶质细胞以及相应炎症因子,如IL-6,TGF-β以及TNF-α蛋白含量,使用PCR技术检测相关m RNA水平,使用小动物MRI技术检测各组幼鼠脑皮层厚度及脑室扩张体积。结果腹腔注射米诺环素能增加GMH 24小时后CB2R表达量,同时减少早期神经炎症因子的释放,减轻幼鼠脑含水量以及活化小胶质细胞数;28天7.0T MRI T2加权像提示米诺环素可显著减轻GMH诱导的脑室体积扩大以及增加幼鼠脑皮层厚度。使用CB2R选择性抑制剂AM630在诱导GMH前1小时腹腔注射可显著逆转米诺环素的神经保护效应。结论研究发现米诺环素具有减轻GMH后早期脑水肿,抑制神经炎症等保护效应,当使用CB2R选择性抑制剂时米诺还素的神经保护效应被抑制,证实米诺环素可能是通过上调细胞膜蛋白CB2R的表达发挥神经保护效应,为GMH及其并发症提供新的研究靶点。第二部分外源性激活CB2R改善GMH后继发炎症脑损伤的作用及机制研究目的通过体内外研究证实外源性激活CB2R对GMH后小胶质细胞增殖、分化的作用以及MAPK/ERK的磷酸化在该过程中的作用。材料与方法在GMH幼鼠模型的基础上,腹腔注射CB2R选择性抑制剂(AM630,1mg/kg)或CB2R选择性激动剂(JWH133,1.5mg/kg)。检测内源性大麻素受体激活后GMH介导的幼鼠脑水肿变化(脑水含量)、神经元凋亡以及小胶质细胞MAPK/ERK信号通路磷酸化情况;离体培养原代小胶质细胞,使用凝血酶(Thrombin,红细胞裂解产物之一)作为至伤物构建离体脑出血单一因素环境,观察小胶质细胞在凝血酶以及JWH133干预后的增殖情况以及MAPK/ERK信号通路磷酸化程度。结果腹腔注射CB2R选择性激动剂JWH133与注射米诺环素具有相似的神经保护效应,如减轻GMH诱导的脑水肿以及减轻脑室扩张,减少血肿周围小胶质细胞增殖、分化,同时JWH133能减少血肿周围神经元的凋亡。通过在体与离体实验观察,发现JWH133能抑制MAPK/ERK蛋白磷酸化水平,进而减少活化小胶质细胞增殖、分化。结论外源性激活CB2R通过抑制GMH后小胶质细胞MAPK/ERK磷酸化水平,减少激活小胶质增殖、分化,同时减少神经炎症因子的释放并干预继发性脑损伤。该研究进一步阐明CB2R在GMH后的神经保护机制,为CB2R选择性激动剂的临床转化提供理论依据。第三部分CB2R选择性激动剂促进GMH后神经修复的作用及机制研究目的该部分拟证实CB2R选择性激动剂(JWH133)是否能在GMH后增加CX3CR1阳性小胶质细胞数量,并上调脑源性神经营养因子(BDNF)释放,促进神经再生。材料与方法在CB2R选择性抑制或激活的基础上,幼鼠脑室内立体定向微量注射CX3CR1sh RNA(预先构建)。使用Brdu、M1小胶质细胞以及M2小胶质细胞特异性marker-CD68/CD206等检测不同干预后小胶质细胞形态变化。使用7.0T MRI-DTI检测CB2R激活后神经纤维束损伤程度,再使用免疫荧光以及Western Blot技术观察小胶质细胞与神经元前体细胞(Neuronal precursor cells,NPCs)的相互作用以及神经元前体细胞增殖等。结果在JWH133治疗GMH幼鼠的基础上,早期脑室内注射CX3CR1 sh RNA以下调神经系统CX3CR1表达,发现JWH133能减少M1型(CD68)活化小胶质细胞的增殖,同时增加M2型(CD206)小胶质细胞增殖,进一步发现JWH133通过增加小胶质细胞CX3CR1膜蛋白水平,促进小胶质下拨向M2形态转换,并释放大量神经营养因子,如脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子(IGF)等,促进GMH损伤的神经纤维束修复以及神经元前体细胞增殖、分化。结论研究证实CB2R选择性激动剂促进M1小胶质细胞向M2形态转换,释放神经营养因子,促进损伤的神经系统修复。本研究证实CB2R激活是小胶质细胞在病理状态下自我调控机制启动的结果,如果人为加以干预,激活CB2R可达到抑制小胶质细胞激活诱导的神经炎症,同时调控小胶质细胞从细胞毒型向神经保护型转换。该研究为出血性脑卒中后继发炎症损伤提供新的研究思路,为新生儿脑出血及其并发症的临床救治提供新策略。