【摘 要】
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由葡萄钩丝壳（Ucinula necator）侵染引起的葡萄白粉病,是全世界范围内葡萄生产中非常严重的病害之一,也是宁夏贺兰山东麓地区葡萄生产中重点防治和监控的对象。葡萄白粉病菌为专性寄生菌,潜育期菌量的定量检测是病害进行早期监测预警的关键环节,但目前有关葡萄白粉病菌潜育期菌量与田间病害发生的关系仍缺乏系统性研究。因此,本研究在明确贺兰山东麓地区葡萄白粉病菌基因型的基础上,建立环介导等温扩增PCR
【基金项目】
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国家重点研发项目（2019YFD1002502）子课题-3“酿酒葡萄病虫害早期多元预警与防控技术研究与示范”； 宁夏回族自治区重点研发项目（2019BBF02013）“宁夏酿酒葡萄病虫害绿色防控关键技术创新与示范”；
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由葡萄钩丝壳（Ucinula necator）侵染引起的葡萄白粉病,是全世界范围内葡萄生产中非常严重的病害之一,也是宁夏贺兰山东麓地区葡萄生产中重点防治和监控的对象。葡萄白粉病菌为专性寄生菌,潜育期菌量的定量检测是病害进行早期监测预警的关键环节,但目前有关葡萄白粉病菌潜育期菌量与田间病害发生的关系仍缺乏系统性研究。因此,本研究在明确贺兰山东麓地区葡萄白粉病菌基因型的基础上,建立环介导等温扩增PCR（Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP）和实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,real-time PCR）检测体系,为葡萄白粉病菌的早期诊断提供技术支持;利用real-time PCR检测体系,分析葡萄白粉病菌潜育期的分子病情指数（molecular-detected disease index,MDI）和田间病情指数（disease index,DI）的相关性,并建立预测模型;进而利用Arc GIS技术对潜育期菌量和田间实际病情进行可视化模拟,以期为贺兰山东麓葡萄白粉病早期预警和防治提供理论依据。研究结果如下:1.在宁夏贺兰山东麓地区7个不同葡萄种植区采集感染葡萄白粉病病叶样品,经单斑分离获得15个菌株,根据TUB2和IGS基因序列设计引物TUB2Fw/TUB2Rev和IGSFw/NS1R,分别获得了213 bp和295 bp的片段,进行酶切扩增多态性序列分析（Cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS）,明确了该地区葡萄白粉病菌均为B基因型;依据CYP51基因序列设计引物Uc592/Uc946,扩增了379 bp的片段,进行单链构象多态性分析（Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP）,明确该地区葡萄白粉病菌拥有2个亚类型（小种）。2.根据葡萄白粉病菌的CYP51基因序列设计LAMP引物,获得了葡萄白粉病菌LAMP最佳反应条件:以UNITF3-1/UNITB3-1为外引物,UNITFIP-1/UNITBIP-1为内引物,反应体系中Bst DNA聚合酶浓度为0.32 U·μL-1,甜菜碱浓度为0.8 mol·L-1,dNTPs浓度为2.6 mmol·L-1,Mg2+浓度为4.8 mmol·L-1,内外引物配比为6:1,在62℃反应60 min,可最低检测到1 pg·μL-1的葡萄白粉病菌,所建立的体系适用于田间葡萄样品的检测,反应稳定且便于操作。3.利用葡萄F-g-6/R-g-6引物和葡萄白粉病菌F-P450-Un/R-Un引物分别建立real-time PCR检测体系,在real-time PCR技术下对葡萄叶片DNA和葡萄白粉病菌DNA经梯度稀释准确定量测定的最低检测量分别为1.0×10-2 ng·μL-1和1.0×10-5 ng·μL-1,分别是常规PCR的100倍和1000倍。建立葡萄叶片DNA和葡萄白粉病菌DNA的标准曲线,分别为y1=26.62-3.18x（R2=0.99637）和y2=17.44-3.03x（R2=0.99564）,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系;利用建立的real-time PCR检测方法对30个田间样品进行检测,共检测到22个样品中含有葡萄白粉病菌,其MDI与DI存在极显著相关性,相关系数为0.916。4.对贺兰山东麓地区3个不同生态区的3块葡萄园样地进行采样调查,利用建立的葡萄和葡萄白粉病菌real-time PCR检测体系,分析3块样地的分子病情指数（MDI）与田间调查的病情指数（DI）的相关性,结果表明:3块样地的MDI和DI存在极显著的相关性,3个样地的MDI值均与采样18 d后的DI值拟合性较高（R12=0.943,R22=0.956,R32=0.966）。利用Arc GIS从空间角度模拟葡萄白粉病潜育期菌量和田间实际发生量,发现3块样地的潜育期菌量和田间发生量均显示出不同的空间结构,半变异函数为指数模型、高斯模型和球型模型,田间种群的空间格局均为聚集分布。利用MDI值和DI值构建预测模型[y=3.521x+0.684（R2=0.810）]进行18 d后田间DI的预测,样地的预测DI与实际DI基本一致,符合率为96.6%。说明利用MDI可以有效地预测葡萄白粉病田间流行的程度和发生趋势,并通过Arc GIS技术实现可视化。
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