【摘 要】
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目的和意义:骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是儿童和青少年常见的恶性肿瘤之一,目前缺乏有效的治疗靶点和诊断标志物,限制了该疾病的临床诊疗及预后。GRP78是一种由热休克蛋白家族A（Hsp70）成员5（HSPA5）编码的应激伴侣葡萄糖调节蛋白,在OS中被认为是一个关键的诊断和预后生物标志物。本课题应用生物信息学方法对OS基因表达谱芯片进行分析,筛选OS预后基因和通路并加以分析,从分子水平探索
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目的和意义:骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是儿童和青少年常见的恶性肿瘤之一,目前缺乏有效的治疗靶点和诊断标志物,限制了该疾病的临床诊疗及预后。GRP78是一种由热休克蛋白家族A（Hsp70）成员5（HSPA5）编码的应激伴侣葡萄糖调节蛋白,在OS中被认为是一个关键的诊断和预后生物标志物。本课题应用生物信息学方法对OS基因表达谱芯片进行分析,筛选OS预后基因和通路并加以分析,从分子水平探索OS的发病机制;为脱氧鬼臼毒素（DPT）通过GRP78治疗OS的分子机制指明方向,并为DPT作为OS的潜在治疗药物提供有力依据。研究方法:基于GEO数据库,应用生物信息学方法筛选与OS有关的差异表达基因进行生物学分析,着重寻找HSPA5与PSAT1和ANXA1之间的潜在相关性。对骨肉瘤和配对癌旁组织标本进行IHC分析。将HSPA5基因稳定转染于OS细胞中进行RT-PCR实验,观察其生物学作用;采用MTT、Edu和平板克隆形成实验考察DPT对OS细胞增殖的影响;用WB初步探索DPT抑制OS的分子机制。流式细胞术分析DPT对OS细胞凋亡的影响,探索DPT促进凋亡的分子机制;动物实验观察GRP78在DPT治疗骨肉瘤中的作用。通过RNA-seq筛选GRP78分子机制,并用WB等方法检测相关蛋白表达,对RNA-seq筛选的结果加以验证。研究结果:1、生物信息学发现,HSPA5和ANXA1在钙粘蛋白结合和细胞粘附分子结合过程中均富集,提示二者在分子水平上可能存在密切相关性。在骨肉瘤组织中HSPA5和PSAT1高表达,而ANXA1表达下调。生存分析显示HSPA5和PSAT1水平与OS预后负相关;ANXA1水平与OS预后正相关。2、体外实验显示,过表达HSPA5的OS细胞中PSAT1水平上调,但是对ANXA1无明显影响;HSPA5沉默能显著提高ANXA1并抑制PSAT1的表达,说明抑制HSPA5可以通过调控ANXA1和PSAT1从而阻止OS的进展。3、IHC显示GRP78在OS组织中高表达。20例OS组织中有16例（80.0%）表达升高,而配对癌旁组织中有5例（25.0%）。GRP78高表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、组织学级别、发病部位、血清乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶水平及远处转移无显著相关性,但与骨肉瘤的临床分期密切相关。4、随DPT浓度增加,OS细胞中的GRP78和PSAT1表达逐渐下调,ANXA1表达上调,且呈时间依赖性。DPT通过上调cPARP、Bax,下调HSPA5、Bcl-2、CCND1、BIRC5等凋亡相关基因发挥促凋亡作用。5、MTT、EdU和平板克隆结果显示,DPT能显著抑制OS细胞的增殖。DPT通过刺激细胞色素C释放和Caspase级联激活的线粒体信号通路诱导OS细胞凋亡,继而对OS细胞生长产生影响。6、流式细胞术显示DPT能诱导OS细胞凋亡,GRP78则能显著减少DPT诱导的细胞凋亡。敲低GRP 78可协同DPT抑制小鼠体内骨肉瘤生长。7、对siGRP78 HOS细胞RNA-seq发现,敲低GRP78可调节OS细胞自噬相关基因的表达水平。DPT通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进OS细胞自噬,且呈剂量依赖性。结论:本研究表明,DPT通过抑制GRP78的表达、活化caspase信号级联,促进OS细胞凋亡;通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进OS细胞自噬,对OS细胞存活起重要作用。
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