第一部分：Maresin1（MaR1）减轻小鼠脑缺血再灌注早期炎症性损伤　　目的：探讨不同剂量MaR1对小鼠脑缺血再灌注早期炎症反应的影响　　方法：采用线栓法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）阻断小鼠大脑中动脉起始部，1小时候后拔出线栓，模拟脑缺血再灌注。75只健康雄性C57小鼠随机分为5组（n=15）：（1）sham组：小鼠行麻醉和颈部血管分离操作与其他组相同，但不插入线栓，术后1小时侧脑室注射生理盐水2.5ul；（2）MCAO组：小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射生理盐水2.5ul；（3）MCAO+0.1ng MaR1组：小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射MaR10.1ng；（4）MCAO+1ng MaR1组：小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射MaR11ng；（5）MCAO+10ng MaR1组：小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射MaR110ng。再灌注后不同时间点取材，如无特殊说明，取材部位为缺血侧皮层，靠近梗死周边部分。采用TTC染色、H&E染色、FJ染色、TUNEL染色评估脑梗死和组织损伤，神经行为学评分评估功能学改变，免疫荧光技术检测中性粒细胞浸润、胶质细胞激活情况，分光光度计检测脑组织中髓过氧化物酶含量。ELISA法检测脑组织中细胞因子含量，Western Blotting技术检测突触相关蛋白的表达水平。　　结果：MCAO组小鼠脑缺血再灌注后，与sham组小鼠相比，再灌注24小时后缺血侧有明显的梗死，染色显示有组织破坏、神经细胞空泡变性伴随炎症细胞浸润，出现较多的细胞凋亡与坏死（P<0.001），再灌注48小时，72小时的神经功能有明显缺陷(P<0.001)，突触相关蛋白表达显著减少(P<0.05)；炎症因子水平、中性粒细胞浸润和胶质细胞激活明显升高(P<0.01)。MCAO术后给予 MaR11ng可显著减小梗死体积(P<0.01)，保护脑组织结构与神经元，减轻细胞死亡(P<0.01)与神经功能受损（P<0.01）。降低炎症因子水平（P<0.01），抑制胶质细胞激活和中性粒细胞浸润和髓过氧化物酶释放。手术后给予0.1ngMaR1有轻微的保护作用但无统计学意义，10ngMaR1组无保护作用，各项指标与MCAO组几乎无差异。数据用均数+标准误显示，数据的分析比较采用 GraphPad Prism5.0.软件，使用单因素方差分析，两组间比较采用Student–Newman–Keuls(SNK)法，P<0.05认为有统计学差异。　　结论：MCAO手术可成功构建脑缺血再灌注模型，各项监测指标显示缺血侧有明显的损伤梗死和炎症反应，侧脑室注射MaR1最佳剂量为1ng时，可显著减轻小鼠脑缺血再灌注早期的炎症反应，从而达减轻脑损伤。　　第二部分：Maresin1减轻小鼠脑缺血再灌注炎症反应的机制研究　　目的：研究MaR1作用于早期脑缺血再灌注炎症反应可能的机制或通路　　方法：线栓法建立小鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。实验分为AB两部分，A部分30只健康雄性C57小鼠随机分为5组（n=6）：（1）sham组：小鼠行麻醉和颈部血管分离操作与其他组相同，但不插入线栓，术后1小时侧脑室注射生理盐水2.5ul；（2） MCAO组：小鼠行 MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射生理盐水2.5ul；（3） MCAO+0.1ng MaR1组：小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射MaR10.1ng；（4）MCAO+1ng MaR1组：小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射MaR11ng；（5）MCAO+10ng MaR1组：小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射MaR110ng。再灌注24小时施行安乐死并取材，免疫荧光技术检测核转录因子NF-κB P65亚单位在胞质胞核的分布情况，Western Blotting技术检测NF-κB P65蛋白磷酸化乙酰化水平 SIRT, Bax和 Bcl2水平，以及P65蛋白在胞核胞质的表达情况。B部分48只健康雄性C57小鼠随机分为4组（n=12）：（1）MCAO组：手术前第5天，第3天，第1天分别腹腔注射一次1％DMSO溶剂对照液，一共注射三次。小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射生理盐水2.5ul；（2）MCAO+1ng MaR1组：手术前第5天，第3天，第1天分别腹腔注射一次1%DMSO溶剂对照液，一共注射三次。小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射 MaR11ng；（3）MCAO+1ng MaR1+EX527组：手术前第5天，第3天，第1天分别腹腔注射一次SIRT1抑制剂EX527（5mg/kg），一共注射三次。小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射MaR11ng；（4）MCAO+EX527组：手术前第5天，第3天，第1天分别腹腔注射一次SIRT1抑制剂EX527（5mg/kg），一共注射三次。小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射生理盐水2.5ul。再灌注24小时后取材，采用TTC染色，H&E染色，FJ染色评估缺血侧脑梗死体积和组织损伤，ELISA检测脑组织炎症因子TNF-α，IL-1β的含量，Western Blotting技术检测SIRT1，乙酰化（acetylation，ac）-NF-κB, Bcl2,Bax蛋白的表达水平。数据分析同第一部分　　结果：A部分缺血再灌注后，MCAO组小鼠Western Blotting与免疫荧光显示，核转录因子NF-κB P65入核明显增多（P<0.001），P65磷酸化增多（P<0.001），同时乙酰化水平增高（P<0.01）。SIRT1蛋白表达下降（P<0.01）。促凋亡因子Bax蛋白水平显著升高，抗凋亡因子Bcl2下降（P<0.01）；MaR1明显抑制MCAO引起的P65的核转位（P<0.001），降低 p65磷酸化和乙酰化水平（P<0.001），同时逆转 Bax与 Bcl2的趋势，上调SIRT1的表达。B部分实验，在MCAO造模前预注射SIRT1抑制剂EX527，再给予MaR1，与MCAO+MaR1组相比，SIRT1蛋白水平下降，乙酰化P65增多，促凋亡蛋白Bax增多抗凋亡蛋白Bcl2减少；梗死体积有所增大，神经损伤加重，但仍比MCAO造模组损伤轻，MCAO+EX527组与MCAO组无明显差别。上述结果说明SIRT1抑制剂使乙酰化NF-κB增多，可部分阻断MaR1的保护作用。　　结论：MaR1对小鼠脑缺血再灌注早期炎症损伤的保护作用可能部分是通过SIRT1-NF-κB通路实现的。　　第三部分：Maresin1对小鼠脑缺血再灌注血脑屏障的影响　　目的：研究MaR1对小鼠脑缺血再灌注血脑屏障损伤是否有保护作用。　　方法：MCAO造模方法同前面部分(n=15)，实验分组：（1）sham组：小鼠行麻醉和颈部血管分离操作与其他组相同，但不插入线栓，术后1小时侧脑室注射生理盐水2.5ul；（2）MCAO组：小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射生理盐水2.5ul；（3）MCAO+MaR1组：小鼠行MCAO手术，再灌注开始时侧脑室注射MaR10.1ng，或1ng，或10ng。再灌注24小时取材。检测脑组织干湿重比，静脉注射依文思蓝评估血脑屏障通透性，明胶酶谱分析脑组织中基质金属蛋白酶 MMP9的活性，免疫捕获技术检测MM3活性，Western Blotting技术分析zo-1,claudin5,MMP9在脑组织中蛋白表达水平，免疫荧光检测血脑屏障组成蛋白zo-1,claudin5的表达趋势与细胞定位。统计学方法同第一部分。　　结果：缺血再灌注处理后，缺血侧脑组织含水量明显增加（P<0.001），依文思蓝渗出明显，即血脑屏障通透性增加（P<0.01），基质金属蛋白酶MMP9和MMP3活性明显升高，血脑屏障组成蛋白zo-1,claudin5表达下降，MM9表达升高（P<0.01），免疫荧光显示趋势大致与Western结果一致。MaR1最佳剂量为1ng时，可显著降低脑缺血再灌注引起的脑水肿和依文思蓝渗出（P<0.05）,抑制 MM9和 MM3的激活，降低MMP9的蛋白表达水平（P<0.01），提高血脑屏障组成蛋白zo-1,claudin5的表达（P<0.01）。　　结论：脑缺血再灌注损伤后，MaR1可保护血脑屏障组成蛋白，抑制基质金属蛋白酶活性，从而降低血脑屏障通透性，改善脑水肿达到脑保护作用。