阿特拉津新型荧光免疫生物条形码检测技术研究

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阿特拉津(Atrazine,ATZ)自二十世纪中期发现以来,是世界各地广泛的使用的一类除草剂,人口数量的增加使得人们对于粮食的需求只增不减,因此除草剂在农业中的广泛使用是不可避免的,但在粮食增产的过程中,除草剂的使用也增加了环境污染。土壤中的阿特拉津会通过自然循环系统最终污染农作物和水。高浓度的阿特拉津会影响水生动物和人类的神经内分泌以及生殖发育。多项关于饮用水的流行病学研究统计表明,阿特拉津对人体具有一定的致癌风险。考虑到阿特拉津对人体的潜在危害,有必要开发一种快速有效的检测方法。对于阿特拉津等农药残留的检测,在实验室常用液相色谱法等这类大型仪器进行检测,这些传统大型仪器分析方式已经比较成熟,且我国食品安全检测标准体系中已经给出了利用液相色谱对阿特拉津的检测方法。尽管大型仪器检测阿特拉津有着许多的优点,但是在检测过程中对于样品具有较高的要求,通常需要繁琐的前处理步骤,而且样品的检测时间相对于快速检测方法需要的时间更长。检测的仪器往往价格比较昂贵,并且需要专业受过培训的人才能检测,在实际快速分析应用中受到限制。近年来,免疫分析法逐渐被引入到生物传感器检、测领域中,其主要的核心关键在于抗原抗体的结合,这有利于提高检测对于基质复杂样品的选择性。另一方面,传统的免疫分析方法有着其特异性强的优点,但其检测灵敏度和检测方式仍然不能满足快速检测阿特拉津的需求,结合纳米材料和信号放大手段在开发新的免疫分析方法是必不可少的。本文以阿特拉津作为目标物,分别建立了一种基于免疫磁珠的酶联免疫分析荧光检测方法和一种基于功能化探针竞争性免疫条形码荧光检测方法,具体如下:(1)免疫磁珠酶联荧光检测阿特拉津的方法的建立。修饰有牛血清白蛋白-阿特拉津完全抗原(BSA-ATZ complete antigen)磁纳米探针与阿特拉津小分子竞争性结合抗阿特拉津单克隆抗体(anti-ATZ m Ab)。磁分离洗脱除去未识别的阿特拉津小分子,从而将MMPs/抗阿特拉津单克隆抗体复合物保留下来,酶标羊抗小鼠二抗可以特异性识别MMPs/抗阿特拉津单克隆抗体复合物,二抗上标记有辣根过氧化物酶(HRP),可以利用过氧化氢(H2O2)作为底物液,使荧光红染料发生氧化生成强烈的荧光物质试卤灵(resorufin)。该方法的检测范围为2ng·m L-1-100 ng·m L-1之间,对于海河水样以及自来水水样的加标回收率范围在96.43%-102.40%之间。(2)采用功能化金纳米探针竞争性免疫条形码检测阿特拉津的方法。制备同时修饰有抗体和DNA条形码的双功能探针(dual functional probe,DFP),既可以识别目标物,同时起到信号放大的作用。在本方法中利用了环糊精修饰的金纳米材料利用其优异的主客体作用,一步法将抗体和5’端修饰有芘荧光基团的DNA链共价修饰在金纳米材料上。然后构建的磁纳米探针可以与小分子竞争性结合制备的功能化金纳米探针。磁分离MMP/DFP复合物后,在hemin与K+存在下,辅助修饰在DFP的G-四链体折叠形成稳定的G-四链体/氯化血红素DNA酶,催化以过氧化氢为介导的荧光红染料的氧化,生成强烈的荧光物质试卤灵。该方法对于阿特拉津的检测范围0.01 ng·m L-1~100 ng·m L-1之间。通过计算得到的最低检测限为0.0047 ng·m L-1。本研究基于生物条形码技术和免疫磁分离技术,建立了两种检测ATZ的荧光分析方法,和传统的抗体识别相比,制备功能化纳米探针有利于提高检测的灵敏度,对信号进一步放大。以上方法,为ATZ的快速检测和现场监测提供了新的思路和平台。
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