在我国，膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。90％的膀胱癌是移行细胞癌，其中70-75％是浅表性膀胱癌。在浅表性膀胱癌中，95％为高危险性浅表性癌。膀胱癌复发率较高，单纯手术治疗约有40％在两年内复发，远期复发率几乎100％，其中浅表性膀胱癌有10％进展为浸润性膀胱癌。高危浅表性肿瘤术后若不给予任何药物治疗，其近期复发率为60-90％。根据膀胱癌易复发的特点，实行术后药物灌注可以达到清除残余瘤体，预防复发和延缓进展的目的。BCG是一种有效的膀胱腔内灌注药，可以预防膀胱肿瘤复发，治疗膀胱原位癌，防治膀胱肿瘤进展及降低死亡率。在众多浅表性膀胱癌的免疫治疗方法中，BCG作为预防性免疫治疗方法是最有价值的；但仍有30-45％的病人对腔内BCG灌注治疗无反应。而且随着BCG治疗的病例数的增加，腔内BCG灌注所致的膀胱局部、全身反应和毒副作用逐渐增加。其中5％患者可出现严重并发症，0.5％甚至可以危及生命。并发症的发生严重影响了患者的依从性，使患者不能完成整个治疗过程。在Pasadoro报道的治疗组中，只有19％的患者完成了全部治疗，其余病例均因并发症或不良反应而放弃维持治疗。因此，BCG腔内灌注用于预防膀胱肿瘤复发和治疗浅表膀胱肿瘤受到一定的限制。有鉴于此，寻找与研究一种患者依从性好、并发症低、具有抗膀胱肿瘤作用的、拥有我国独立知识产权的膀胱灌注治疗方法。冬凌草是近年来发现的具有广泛抗肿瘤作用的纯天然植物。但作为膀胱腔内灌注药物预防与治疗浅表性膀胱肿瘤的作用机制尚不清楚。为了提取与制备适合膀胱腔内灌注的天然药物制剂，本课题采用乙醇回流法从冬凌草中分离得到了高纯度的ORI，水提取法得到了RRP；细胞实验分别研究了ORI和RRP抗膀胱肿瘤细胞系MB49细胞、EJ细胞和T24细胞的作用及其机制；在我们建立的C57BL／6小鼠原位膀胱肿瘤模型上，初步研究了ORI和RRP膀胱灌注治疗小鼠膀胱肿瘤的作用及其机制，为冬凌草提取物膀胱灌注预防和治疗浅表膀胱癌天然药物的开发提供科学的实验依据。第一部分冬凌草甲素和冬凌草多糖的制备目的：提取分离冬凌草甲素和冬凌草多糖，为抗膀胱肿瘤细胞实验和动物实验提供样品。方法：乙醇回流法提取总二萜类，采用硅胶柱层析法分离纯化冬凌草甲素，以高效液相层析法(HPLC)鉴定和测定冬凌草甲素的含量。冬凌草多糖采用水提取、乙醇沉淀法进行提取分离，用有机溶剂纯化。结果：1000g冬凌草叶共提取得到冬凌草甲素2.2g，纯度高达98％，提取率为0.22％。200g冬凌草叶共提取得到冬凌草多糖约8.1g，提取率为4.05％。结论：乙醇回流法是较理想的提取冬凌草甲素的方法，水提取、乙醇沉淀法是较理想的提取冬凌草多糖的方法。第二部分冬凌草甲素和冬凌草多糖抗膀胱肿瘤细胞系的实验研究目的：研究ORI和RRP对膀胱肿瘤细胞系MB49细胞、EJ细胞和T24细胞的作用及机制。方法：用MTT法检测ORI和RRP对MB49、EJ、T24的生长抑制作用；用光学显微镜和电子显微镜、Hoechst33258荧光染色法观察细胞的形态学变化；凝胶电泳观察细胞的DNA片断化；FCM Annexin V-PI双染色法检测细胞凋亡率；Caspase分光光度法检测Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性变化；Western blot检测Bcl-2和Bax表达的变化；PCR-TRAP-银染法检测端粒酶活性变化。结果：ORI、RRP对MB49细胞、EJ细胞和T24细胞均有明显的生长抑制作用，呈明显的时间-效应关系和浓度-效应关系。作用24h时，ORI对MB49细胞、EJ细胞和T24细胞的IC50分别为16μmol／L、25.6μmol／L和27.2μmol／L。联合应用ORI和RRP对MB49细胞有相加作用，对EJ细胞和T24细胞有协同作用。形态学观察，凋亡细胞数随ORI作用时间延长而增加，见凋亡小体出现。DNA电泳看到DNA ladder。Annexin V-FITC-PI双染色FCM检查发现，随着ORI作用浓度增加，凋亡细胞数和坏死细胞数均增加，浓度越高，坏死细胞的比率增加越多。Caspase分光光度法检测结果发现，随着ORI作用时间延长，MB49细胞、EJ细胞和T24细胞的Caspase-3和Caspase-9活性均升高，EJ细胞和T24的Caspase-8活性升高，但MB49细胞的Caspase-8未见明显变化。Western blot显示，随着ORI作用时间延长，三种细胞Bcl-2的表达均逐渐减弱，Bax的表达均逐渐增强。PCR-TRAP-银染法检测显示，MB49细胞的端粒酶活性随着ORI作用时间的延长而逐渐减弱。结论：冬凌草提取物ORI和RRP对膀胱肿瘤细胞系有明显的抗肿瘤作用。ORI低浓度时主要引起膀胱肿瘤系凋亡，高浓度时有直接的细胞毒作用。在EJ细胞和T24细胞，ORI可能主要通过Fas／FasL-线粒体途径和Apo2L／TRAIL-Caspase-8激活Caspase家族，导致凋亡的发生；在MB49细胞，ORI可能主要通过Fas／FasL-线粒体途径导致凋亡的发生。第三部分冬凌草甲素和冬凌草多糖膀胱灌注治疗小鼠膀胱肿瘤的实验研究目的：建立小鼠原位膀胱肿瘤模型；探讨ORI和RRP膀胱灌注后的疗效及其机制；观察膀胱灌注用药对膀胱及全身重要器官的影响。方法：采用硝酸银灼伤、MB49细胞膀胱灌注的方法建立C57BL／6小鼠原位膀胱肿瘤模型，常规病理检查和电子显微镜检查诊断膀胱肿瘤，计算肿瘤接种成功率；建立模型后10d，四组小鼠各15只，分别灌注PBS、ORI、RRP、ORI和RRP，每5d灌注一次，灌注四次后1w处死小鼠，FCM检查血液淋巴细胞亚群变化，常规病理检查膀胱和心、肝、脾、肺、肾，了解灌注后对膀胱和重要器官的影响，并计算各自的治愈率。TUNEL检测残存肿瘤凋亡。结果：C57BL／6小鼠原位膀胱肿瘤模型的成瘤率为96.7％。ORI组治愈率为80％，RRP为60％，联合用药组为93.3％，均明显高于对照组的13.3％；ORI组和联合用药组明显高于RRP组。TUNEL检测显示，ORI组、RRP组和联合用药组残存肿瘤细胞出现凋亡，越近肿瘤表面，凋亡越明显。灌注后，血液淋巴细胞亚群各组无差别，膀胱除ORI组和联合用药组的移行上皮明显变薄外，无其它异常改变。各组的肝、脾、肺、心、肾未见明显损害。结论：硝酸银灼伤、MB49膀胱灌注建立起来的C57BL／6小鼠原位膀胱肿瘤模型是一种较为理想的原位肿瘤模型。ORI、RRP具有明显的抗小鼠膀胱肿瘤作用，其作用机制可能为诱发肿瘤细胞凋亡。ORI、RRP膀胱灌注治疗小鼠膀胱肿瘤对膀胱及全身重要器官是安全的。