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目的:通过3D打印技术制备聚己内脂/β-磷酸三钙/硫酸钙(polycaprolactone/β-tricalcium phosphate/calciumsulfate,PCL/β-TCP/CS)复合人工骨支架,对其形态、性能及体内外的生物安全性进行研究;通过两步法制备磁性壳聚糖和磁性脂质体,探索其在骨缺损基因治疗中的潜力。方法:1.通过3D打印技术制备PCL/β-TCP/CS复合人工骨支架(PCL:β-TCP:CS比例为80:5:15,80:10:10,80:15:5,分别简称为P/T/S5,P/T/S10,P/T/S15),并对其微观形态、孔隙结构、孔隙率及力学强度进行表征。2.按照0.1g/ml浓度制备支架浸提液。采用CCK-8法检测复合支架材料的细胞毒性,应用碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色检测其诱导C3H10细胞成骨分化的能力。3.选取健康的新西兰大白兔4只,分为P/T/S5,P/T/S10,P/T/S15三组及空白对照组,随机将每组复合支架植入大白兔双侧股四头肌肌肉深处,对照组行相同外科手术。于植入后1月取出标本,肝肾脏及骨支架周围肌肉行HE染色,评价复合支架的组织相容性和生物安全性。另选取一只新西兰大白兔制作左侧桡骨缺损,植入复合支架,于6月后暴露骨缺损部位,初步观察支架对骨愈合的修复作用。4.化学共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米粒,分别与阳离子聚合物壳聚糖及阳离子脂质体按照一定浓度比例复合为磁性壳聚糖及磁性脂质体,并对其形态、磁感应性、Zeta电势等进行表征。5.将磁性壳聚糖及磁性脂质体通过静电吸附作用与质粒(pAd TRACKBMP9)结合,磁场作用下分别转染人成骨类细胞MG63细胞,利用倒置荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率。然后对MG63细胞进行成骨诱导分化,碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色检测BMP9蛋白诱导成骨分化的能力。结果:1.复合支架内部具有丰富的孔隙结构,宏观孔隙大小约400um,微观孔隙约为10um,孔隙率在55%-65%之间,与预先利用三维建模软件所设计的支架结构相近,孔隙之间相互连通。PCL支架的表面较为光滑,而PCL/β-TCP/CS复合支架表面粗糙,有部分β-磷酸三钙和硫酸钙颗粒暴露在复合支架表面。复合支架弹性模量较PCL支架明显提升,基本可以达到松质骨水平。2.体外C3H10细胞的毒性实验结果显示各组细胞存活率皆在90%以上,表明PCL和β-磷酸三钙、硫酸钙均具有较好的生物相容性。C3H10细胞在复合支架浸提液中培育,7天时行碱性磷酸酶(ALP)染色显示部分细胞可见蓝色颗粒,而PCL支架浸提液培育的细胞与阴性空白对照组仅有极少的ALP阳性的细胞,21天时茜素红染色与ALP染色结果相一致。3.各组复合人工骨支架植入一月后,支架形态正常,与周围肌肉组织连接不紧密,肌肉组织未见萎缩,无明显水肿,HE染色显示炎症细胞较少,炎症反应轻微。肝脏及肾脏行石蜡切片、HE染色,结果显示肝肾组织均无明显坏死及组织反应情况。复合支架植入桡骨缺损6月后,支架周围组织形态完整,支架内可见明显的新生骨组织生成。4.磁性Fe3O4纳米粒可以在水溶液中稳定分散,电镜下呈圆形或类圆形,粒径均一。与壳聚糖和阳离子脂质体复合后粒径增加。羧基化磁性Fe3O4纳米粒表面带负电荷,Zeta电位为-25mV,与壳聚糖和阳离子脂质体复合后Zeta电位分别为28.5mV和31.1mV。CCK-8法检测结果表明磁性Fe3O4纳米粒及磁性壳聚糖均无明显细胞毒性,而磁性脂质体由于阳离子脂质体而表现出一定的细胞毒性。5.转染24h后通过荧光显微镜观察,发现除裸质粒外均能够将质粒(pAd TRACKBMP9)转染到MG63细胞中,磁场作用下磁性脂质体在15min时便能够将大量质粒沉淀到细胞膜表面并转染到细胞内,转染效率较lipo2000明显提高。流式细胞术结果与荧光显微镜观察结果一致。碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色结果表明,成功转染BMP9质粒后可有效诱导MG63细胞的成骨分化,且成骨分化能力与质粒转染效率相关。结论:通过3D打印技术制备的PCL/β-TCP/CS复合人工骨支架表面粗糙,孔隙丰富,力学性能较PCL支架好,基本达到松质骨水平。体外的细胞实验及体内实验结果显示复合支架具备良好的生物安全性和组织相容性,不引起明显的组织炎症反应和毒理作用,能够促进骨缺损愈合;所构建的磁性壳聚糖及磁性脂质体均带正电荷,能够与质粒(pAd TRACKBMP9)很好的复合,在磁场作用下能够将质粒转染到MG63细胞中,而磁性脂质体转染效率高于磁性壳聚糖(P>0.05),转染后质粒(pAd TRACKBMP9)能够促进细胞成骨分化。PCL/β-TCP/CS复合人工骨支架有望作为一种新型的组织工程骨支架,与磁性基因载体联合应用,为临床骨缺损的治疗提供新的方向。