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目的:检测ApoE基因敲除型(ApoE-/-)和野生型(WT)小鼠多发性硬化动物模型脑组织中p65/NF-κ B、MMP-9的表达情况;探索ApoE影响星形胶质细胞分泌MMP-9的可能机制,是否通过TNF-α/NF-κ B炎症通路起调节作用;利用生物信息学技术,探索TNF-α刺激星形胶质细胞的差异基因和关键通路。方法1.免疫诱导野生型和ApoE敲除型小鼠建立EAE模型,免疫组化检测各组小鼠脑组织中MMP-9和p65表达情况,实验动物可分为4组:W-EAE组、W-Control 组以及 E-EAE 组、E-Control 组;2.WT和ApoE-/-小鼠原代星形胶质细胞培养并通过免疫荧光法鉴定星形胶质细胞;3.慢病毒包装siRNA干扰WT和ApoE-/-小鼠原代星形胶质细胞中RelA(p65)基因表达,WT和ApoE-/-星形胶质细胞可分为6组:W-KD组、W-NC组、W-Control 组以及 E-KD 组、E-NC 组、E-Control 组;4.RT-PCR、Western Blot检测p65基因沉默效率,观察p65低表达对星形胶质细胞分泌MMP-9、TNF-α的影响;5.p65低表达后,ELISA、RT-PCR检测 TNF-α干预对WT和ApoE-/-小鼠星形胶质细胞MMP-9表达的影响;6.GEO数据库下载GSE73022,通过KEGG-pathway、蛋白互作网络和GO分析,找出TNF-α对野生型小鼠星形胶质细胞差异基因和富集的关键通路。结果1.根据Weaver’s 15分法的标准进行神经功能评分,慢性期(第35天)ApoE-/-组评分高于WT组(P<0.05);2.通过免疫组化检测结果显示,与WT-EAE相比,ApoE-/-小鼠EAE脑组织中p65、MMP-9分泌较高(P<0.05);3.免疫荧光鉴定星形胶质细胞,倒置显微镜观察显示,培养的小鼠原代星形胶质细胞的纯度>90%,可为后续实验细胞;4.mRNA水平和蛋白质水平检测结果,显示慢病毒包装的siRNA能够显著抑制p65在体外星形胶质细胞中的表达(P<0.05);5.RT-PCR结果显示,与阴性空载组及对照组比较,p65基因沉默组MMP-9呈现低表达(P<0.05);ELISA结果显示,与正常组小鼠相比,E-KD组和W-KD组星形胶质细胞中的MMP-9的表达水平均降低(P<0.05),E-KD组星形胶质细胞的MMP-9的表达水平稍高于W-KD组(P<0.05);6.加入50ng/ml TNF-α 24小时后,ELISA结果显示,与炎症因子处理前比较,NC组和Control组星形胶质细胞的MMP-9表达量升高(P<0.05);T-KD组星形胶质细胞的MMP-9的表达水平稍高于KD组,但差异无统计学意义(P>0.05),但ApoE-/-组表达量均高于WT组(P<0.05);7.R语言分析结果发现,TNF-α刺激星形胶质细胞后,发现上调基因386个,下调基因181个,得到的核心基因包括趋化因子CXCL9/10/11、IL-6、Tnfaip3、MYD88、STAT2等;差异基因富集的通路包括TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NF-K B信号传导途径以及NOD样受体信号通路等。结论1.慢性期ApoE缺乏会加重EAE病情,且ApoE-/-小鼠EAE脑组织中p65、MMP-9呈高表达状态;2.p65基因在ApoE-/-小鼠星形胶质细胞中高表达,p65基因沉默能够显著抑制MMP-9、TNF-α分泌水平;3.在促炎因子TNF-α的作用下,星形胶质细胞MMP-9表达增加,说明TNF-α能正向调节星形胶质细胞MMP-9的表达;4.阻断NF-K B途经后,抑制了 TNF-α对星形胶质细胞表达MMP-9的影响,说明TNF-α可通过NF-κ B途径调星形胶质细胞表达MMP-9,且ApoE缺乏会引起星形胶质细胞分泌MMP-9增加;5.关于TNF-α对星形胶质细胞的影响的生物信息学研究,可为抗炎作用在中枢神经系统相关疾病的治疗提供新思路。