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背景: 糖尿病(Diabetic mellitus,DM)是以血糖水平升高、伴有微血管和大血管并发症为特征的一组代谢紊乱性疾病,糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)作为DM最常见的微血管并发症之一,是导致DM相关终末期肾病的重要原因[1-3],主要表现为进展性白蛋白尿、肾小球滤过率下降、肾脏结构和功能损伤等[4]。目前关于DN的确切发病机制尚不完全清楚,遗传因素、血流动力学改变、晚期糖基化终产物积聚、多种细胞因子活化等均可能在DN的启动和进展过程中发挥一定作用。Notch基因由Morgan等在果蝇体内首先发现,其蛋白广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物,Notch通路在DN进展过程中明显活化,并可介导肾小球及肾小管功能损伤,促进肾间质纤维化和新生血管生成[5-7]。炎症、高糖刺激等条件诱导肾脏局部的肾素-血管紧张素Ⅱ系统(Renin-angiotensinⅡ system,RAS)活化,血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)作为该系统重要的活性成分,激活后与AngⅡ受体1(AngⅡtype1 receptor, AT1)结合,可增加肾小球毛细血管内压力和血浆蛋白滤过率,进一步加重尿蛋白的排出,在DN的进展中发挥重要作用[8]。阻断RAS因此成为DN防治的一个重要策略,目前此类药物主要包括血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme,ACEI)和AngⅡ受体拮抗剂(AngⅡ receptor blocker,ARB)。研究发现Notch通路可能部分介导AngⅡ引起的DN肾脏足细胞损伤过程,且ARB可通过抑制该通路发挥一定肾脏保护作用[9]。 目的: 1、观察不同尿白蛋白(以尿白蛋白/尿肌酐即ACR表示)的2型糖尿病(Type2diabetes mellitus,T2DM)患者血清AngⅡ、Notch1浓度变化及临床意义; 2、探讨在高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(Rat mesangial cells,RMCs)外基质分泌及纤维化中Notch通路的作用以及ARB类药物缬沙坦的保护作用。 方法: 1、临床研究部分:252例T2DM患者根据ACR分为正常白蛋白尿组(NA,ACR<30mg/g)、微量白蛋白尿组(MA,ACR30-300mg/g)、大量白蛋白尿组(LA,ACR≥300mg/g),90例我院体检中心体检结果正常者为正常对照组(NC)。ELISA法检测血清AngⅡ、Notch1水平,并分析比较各组基本临床资料、相关代谢指标及ACR水平。 2、实验研究部分:将传代培养的RMCs同步化后分组:(1)正常糖对照组(NG,含5.5mmol/L葡萄糖);(2)高糖组(HG,含30.0mmol/L葡萄糖);(3)高渗对照组(HM,含5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇);(4)正常糖+DAPT(γ分泌素抑制剂,Notch信号通路抑制剂)组(NG+D,DAPT浓度为1μmol/L);(5)正常糖+缬沙坦组(NG+V,缬沙坦浓度分别为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L);(6)高糖+DAPT组(HG+D,DAPT浓度为1μmol/L);(7)高糖+缬沙坦组(HG+V,缬沙坦浓度分别为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L),培养12、24、48小时后收集细胞及上清液,WesternBlot法检测Notch1蛋白表达情况,ELISA法检测上清液细胞外基质转化生长因子-β(Transforming growth factor, TGF-β)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)水平。 结果: 1、临床研究部分 (1)ACR水平在各组之间差异具有统计学意义(P<0.001); (2)AngⅡ在各组之间无明显差异(P>0.05); (3)与NC组相比,T2DM各组血清Notch1水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.001),且随着尿白蛋白水平增加,T2DM各组血清Notch1水平逐渐升高(P<0.001); (4)相关分析结果表明,AngⅡ与Notch1之间呈显著正相关(r=0.617,P<0.001); (5)多重线性回归分析结果显示Notch1、AngⅡ、糖尿病病程、血尿酸、收缩压、糖化血红蛋白对ACR有显著影响,且Notch1对ACR的影响最大(t=20.726,P<0.001)。 2、实验研究部分 (1)与NG组相比,高糖刺激RMCs12h左右可检测到Notch1表达升高,峰值出现在24h(P<0.05),HM组与NG组相比差异无统计学意义(P>0.05); (2)与NG组相比,高糖状态下RMCs上清液中TGF-β、FN分泌量随时间明显升高(P<0.05),HM组与NG组相比差异无统计学意义(P>0.05); (3)高糖状态下缬沙坦或DAPT预处理组与未处理组相比,培养24h左右,Notch1表达明显减少(P<0.05);与未处理组相比,随缬沙坦浓度增加,Notch1表达逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05); (4)高糖状态下,与未处理组相比,缬沙坦或DAPT预处理组TGF-β、FN蛋白分泌量均明显下降(P<0.05)。 结论: 1、血清Notch1可能作为早期DN诊断和预测白蛋白尿发生的新指标; 2、高糖可刺激培养的RMCs中Notch通路活化,上调下游TGF-β、FN分泌等,可能促进RMCs纤维化过程; 3、DAPT可抑制Notch通路下调培养的RMCs上清液TGF-β、FN分泌,可能显著改善高糖诱导的RMCs纤维化过程; 4、缬沙坦可能通过抑制AngⅡ-Notch通路下调培养的RMCs上清液TGF-β、FN分泌,显著改善高糖诱导的RMCs纤维化过程,可能发挥一定肾脏保护作用,且这种保护作用呈浓度依赖性。