目的:K-Ras作为一个常见的癌基因,常常与不同类型的肿瘤的恶性行为密不可分,但其在去势抵抗性前列腺癌(Castration Resistant Prostate Cancer,CRPC)中研究甚少。我们前期研究发现H-Ras、K-Ras在CRPC中表达上升,但其升高的机制需进一步探讨。本研究的目的在于探究K-Ras基因在CRPC中的具体机制,是否与肿瘤的进展、转移、耐药相关以及在临床上是否能够作为治疗CRPC的关键分子,并为CRPC的治疗提供一个新的方案。方法:(1)临床资料收集:50个前列腺癌(primary prostate cancer,PPC)患者和41个CRPC患者的组织样本的收集,是从2010年1月到2019年7月于重庆医科大学附属第一医院泌尿外科完成。所有受试者或其家属均被告知了本实验研究的目的以及研究的程序步骤。我们研究中CRPC患者完全是按照欧洲泌尿外科协会(EU)的指南来定义的。本研究回顾性的分析了患者的年龄、血液中前列腺特异性抗原(PSA)的水平、转移以及患者耐药的情况。经过重庆医科大学伦理委员会批准,并按照《赫尔辛基宣言》的原则进行。本课题通过使用免疫组化(IHC)和Western blot来检测前列腺癌组织中K-Ras、PLCε、PKCε的蛋白水平表达的情况,统计学分析各种基因蛋白水平的变化和相互之间的相关性,并分析KRas蛋白的表达与患者的临床特点、人口学特征和生存期等在统计学上的相关性。(2)细胞学现象研究:以LNCaP细胞为基础细胞,培养比卡鲁胺耐药细胞(R-Bica细胞)、比卡鲁胺+多西他赛双重耐药细胞(R-B+D细胞)。通过IC50实验来验证两株耐药细胞株是否构建成功,分别得到对不同细胞株的增殖抑制率在50%时的药物浓度。同时我们通过qPCR、Western blot检测LNCaP、R-Bica、R-B+D细胞中,K-Ras、PLCε、PKCε基因水平和蛋白水平的表达情况;通过3个不同的小干扰RNA来敲低耐药细胞株(R-Bica、R-B+D)中K-Ras基因的表达,选取敲低效率最高的小干扰RNA进行后续研究,细胞增殖抑制率用于检测不同处理的细胞株中,细胞对药物的敏感性;克隆形成实验和CCK-8实验用来检测不同处理组中细胞的增殖情况。Western blot、侵袭实验、划痕实验分别检测K-Ras基因敲出组和对照组(Negative Control,NC)中,转移、侵袭相关基因的表达和转移、侵袭能力的变化。(3)细胞学机制研究:选取K-Ras敲低效率最高的sh-K-Ras R-Bica、sh-K-Ras R-B+D细胞株及其对应的NC组以及未处理的空白R-Bica、R-B+D细胞株。(1)Western blot、qPCR验证在不同处理组中,下游基因PLCε、PKCε基因水平和蛋白水平的变化情况。(2)使用过表达K-RasG12C的慢病毒处理不同细胞株,Western blot、qPCR检测了其下游因子PLCε、PKCε的表达情况,通过PLCε膜浆蛋白的表达水平,定位下游因子PLCε在细胞中起作用的位置。(3)免疫共沉淀实验(Co-IP)确定了K-Ras、PLCε、PKCε这三种基因在蛋白水平上的直接相关的关系。同时,选取敲低K-Ras基因的耐药细胞和未处理的耐药细胞株完成后续实验,(4)使用三组敲低PKCε小干扰RNA对耐药细胞株R-Bica、R-B+D中的PKCε基因进行敲低,通过Western blot、qPCR进行验证,选取效率最高一组进行接下来实验。(5)在敲低K-Ras、PKCε的各组耐药细胞株中进行检测转移相关因子,如VEGF、MMP2、MMP9的基因和蛋白的变化情况。(6)Transwell和划痕实验来检测其侵袭、迁移的能力。(7)IC50来检测各个细胞株对药物的敏感性。(4)药物研究K-RasG12C的抑制剂(Inhibitor 9)体外实验:选取两组未做任何处理的耐药细胞株(R-Bica、R-B+D)。(1)在培养基中分别加入Inhibitor 9和空白对照PBS。(2)观察各组细胞系中,与侵袭相关的因子MMP2、MMP9、VEGF,在基因水平和蛋白水平的变化情况。(3)通过CCK-8法,检测inhibitor 9影响耐药细胞株增殖的情况及在其细胞学水平上最适合的浓度。(4)通过IC50来观察使用了抑制剂后,细胞对药物敏感性的恢复情况。(5)裸鼠移植瘤体内实验:K-Ras抑制剂inhibitor 9体内实验,选取两株耐药细胞株(R-Bica、R-B+D)在雄性裸鼠体内进行实验。将动物进行实验分组:给予inhibitor 9、比卡鲁胺或者比卡鲁胺+多西他赛的雄性小鼠为实验组、给与PBS安慰剂、比卡鲁胺或者比卡鲁胺+多西他赛喂养为对照组。(1)尾静脉注射肿瘤细胞,构建裸鼠的内脏转移模型:用flag荧光标签标记两株耐药细胞(R-Bica、R-B+D),将小鼠分组为:R-Bica(Inhibitor9)、R-Bica(PBS)、R-B+D(Inhibitor 9)、R-B+D(PBS),从14天开始给予inhibitor 9或者PBS尾静脉注射,通过活体成像仪在给药后的21天、42天进行观察其内脏转移情况。(2)骨转移模型:在裸鼠右侧胫骨平台处分别注射耐药细胞系(R-Bica、R-B+D),与转移模型的处理方式一致,在42天通过影像学检查观察肿瘤细胞的侵袭情况,将裸鼠的右侧胫骨切下,做HE染色之后,观察其组织标本的侵袭情况。(3)皮下成瘤模型:分别于裸鼠左侧腹部皮下成瘤,处理方式与上述模型一致,观察裸鼠皮下瘤子的大小。结果:(1)通过免疫组织化学分析检测,在CRPC组织中,K-Ras、PLCε、PKCε的表达与PPC相比,均呈现出不同程度的上调(P值分别为0.014,0.007,0.018)。同时,K-Ras与PLCε、PKCε蛋白的表达水平之间存在着正相关性(PLCε,r=0.4,P=0.0084),(PKCε,r=0.42,P=0.0065);通过Western blot来检测了13例CRPC患者组织中的K-Ras、PLCε、PKCε的表达情况,其结果与免疫组化相似,K-Ras与PLCε、PKCε蛋白的表达水平之间存在着正相关性(PLCε,r=0.58,P=0.04),(PKCε,r=0.65,P=0.02)。而患者的人口学和临床特点分析发现,K-Ras的阳性表达与肿瘤患者的转移呈正相关,(PPC患者中骨转移、内脏转移分别为(P=0.01,P=0.018),CRPC患者中分别为(P=0.009,P=0.046))。对41位CRPC患者通过Kaplan-Meier来进行生存分析,提示K-Ras阴性的患者其无进展中位生存期(Recurrence-free survival,RFS)为38个月,而K-Ras阳性的患者无进展中位生存期为27个月,表明K-Ras阳性与RFS呈负相关(P=0.007)。(2)通过用IC50结果,检测各株细胞的对药物的敏感性,结果显示比卡鲁胺对耐药细胞株R-Bica细胞50%的抑制率为105.9μM,比卡鲁胺+多西他赛对耐药细胞株R-B+D细胞50%的抑制率为111.5μM,其药物剂量是原始LNCaP细胞株对比卡鲁胺(1.55μM)的67.74倍、对比卡鲁胺+多西他赛(1.689μM)的68.45倍,说明耐药细胞株构建成功。通过Western blot、PCR检测LNCaP、R-Bica、R-B+D细胞中K-Ras、PLCε、PKCε蛋白和基因表达情况。结果表明,三组基因和蛋白在LNCaP细胞中的表达均低于R-Bica、R-B+D细胞,其结果具有统计学意义。IC50结果显示,敲低K-Ras的两株耐药细胞(shK-Ras R-Bica、shK-Ras R-B+D),对药物的敏感性得到了明显的恢复,50%的细胞抑制剂分别为36.09μM和45.49μM,而未处理的耐药细胞株则为:R-Bica(100.7μM)、R-B+D(113.3μM)。同时,通过克隆形成和CCK-8实验发现,敲低K-Ras后肿瘤细胞的增殖受到抑制;同时其转移相关的因子(MMP2、MMP9、VEGF)的蛋白和基因表达上均降低,同时,Transwell和划痕实验证明,细胞的侵袭能力和迁徙能力均下降,其结果均具有统计学意义。(3)在敲低了K-Ras的耐药细胞株中,其下游靶基因PLCε、PKCε的蛋白水平和基因的表达水平均受到了抑制。我们通过K-RasG12C过表达来验证是否这一抑制水平是否会得到逆转。(1)过表达K-RasG12C后,RT-qPCR检测发现,K-RasG12C的表达水平升高;Western blot、RT-qPCR检测发现,在敲低了PLCε基因的耐药细胞中,PKCε的表达下降,而敲低了PLCε基因的耐药细胞中过表达K-RasG12C后,PKCε的表达得到了逆转,说明K-Ras可能是通过PLCε来调控PKCε基因的;(2)PLCε基因的膜浆定位发现,K-RasG12C的过表达引起了定位在细胞膜上的PLCε基因的表达升高,说明PLCε基因的激活主要是通过膜浆转位来实现的;免疫共沉淀(CO-IP)结果显示,在蛋白水平上K-Ras与PLCε、PLCε与PKCε存在着直接结合的情况,证明了K-Ras调控PKCε是通过细胞膜上的PLCε来实现的,并且三者之间存在着在蛋白水平上直接结合。(3)在敲低PKCε基因后,耐药细胞株侵袭、转移相关的因子(VEGF、MMP2、MMP9)的表达在蛋白和基因水平得到了下调;Transwell、划痕实验结果提示,敲低PKCε后,CRPC细胞的侵袭、迁徙能力下降;IC50结果提示,耐药细胞株对药物的敏感性得到了一定恢复,处理组:sh-PKCεR-Bica(43.96μM)、sh-PKCεR-B+D(51.25μM)。对照组:R-Bica(103.1μM)、R-B+D(116.7μM)。上述实验证实了K-Ras能够直接调节PLCε/PKCε通路,而PKCε能够调控CRPC细胞的恶性行为,这说明,K-Ras调节CRPC细胞的恶性行为是通过PLCε/PKCε通路这条通路来实现的。(4)Western blot、RT-qPCR检测结果显示,耐药细胞R-Bica、R-B+D培养基中加入K-RasG12C的抑制剂inhibitor 9后,其转移、侵袭相关因子的表达下调;CCK-8检测发现随着抑制剂的药物浓度的增加,细胞增殖率受到了抑制;IC50检测结果显示,抑制剂能够有效地增加药物的敏感性(实验组加入了抑制剂后:R-Bica(38.8μM)、R-B+D(50.10μM);对照组:R-Bica(103.6μM)、R-B+D(50.10μM))。(5)裸鼠移植瘤体内实验:(1)内脏转移模型:无论是inhibitor 9+比卡鲁胺组或者inhibitor 9+比卡鲁胺+多西他赛组,肿瘤细胞的转移能力均较耐药细胞诱导小鼠明显的抑制,通过活体成像仪显示,肿瘤细胞在42天转移的情况,较21天时转移灶明显缩小。(2)在骨侵袭组模型中,在X片上可以看出无论是inhibitor 9+比卡鲁胺组或者inhibitor 9+比卡鲁胺+多西他赛组,肿瘤细胞的侵袭能力亦较耐药细胞诱导小鼠得到了明显的抑制,实验组的骨膜均存在,而对照组的骨膜已经模糊不清。HE染色结果显示对照组的肿瘤细胞已经穿透了骨膜,而实验组并没有完全穿透骨皮质进去髓腔。(3)加入了inhibitor 9的两个实验组中,其肿瘤大小在均小于其对应的对照组。结果均有统计学意义。结论:本研究探讨了K-Ras基因通过PLCε/PKCε信号通路调节了CRPC细胞的转移以及耐药。同时揭示了K-RasG12C的抑制剂能够恢复CRPC细胞对药物的敏感性,降低耐药细胞的转移性、侵袭性,降低其恶性程度。而K-RasG12C的抑制剂已经进入了临床试验阶段,它将有望成为趋势抵抗性前列腺癌的一个新的治疗方案。