恶性肿瘤是目前威胁人类生命健康的主要疾病之一,其治疗方法主要有手术治疗、化学治疗、放射线治疗,近年来肿瘤的免疫治疗作为肿瘤生物治疗的技术之一,因其副作用小等优点成为科研人员的研究热点。肿瘤的免疫治疗是靶向机体自身免疫系统的一种治疗方法,通过提高自身免疫系统的抗肿瘤能力达到肿瘤治疗的目的。细胞过继免疫治疗是肿瘤免疫治疗的方法之一,是将致敏淋巴细胞输给细胞免疫功能低下者(如肿瘤患者),使其获得抗肿瘤免疫力。细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)是传统的肿瘤杀伤效应T细胞,可以直接杀伤肿瘤细胞,也是目前应用于肿瘤过继免疫治疗的主要效应T细胞。细胞毒性T细胞9(Tc9细胞)是近年来新发现的细胞毒T细胞亚群,相比于目前应用于临床的Tc1细胞而言,具有体内存活时间长,能够发挥长效抗肿瘤作用的优点;此外,有研究表明,虽然Tc9细胞在体外对肿瘤的直接杀伤作用较弱,但Tc9细胞可以在体内分化为Tc1样细胞,使其抗肿瘤作用增强。因此Tc9细胞有望成为更有效的细胞过继免疫治疗的效应T细胞。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是TNF家族成员之一,是一种具有多种生物学功能的细胞因子,不但可以诱导细胞炎性因子的产生,还参与了细胞的增殖、存活以及凋亡等生物学反应。前期研究发现TNF-α可以影响辅助性T细胞(Th细胞)的生成和增殖。由于相同亚型的Th细胞和Tc细胞的极化环境具有相似性,且Tc9细胞在过继免疫治疗中具有巨大潜力。因此,本研究将深入探讨TNF-α对Tc9细胞的影响,以期更有效的诱导和扩增肿瘤特异性Tc9细胞并提高其相关分子(如IL-9)的表达水平,从而更好的发挥其肿瘤免疫疗效。研究主要分为以下三部分:第一部分TNF-α对Tc9细胞的体外诱导作用目的:探究TNF-α对Tc9细胞体外分化,存活以及增殖能力的影响,明确TNF-α对Tc9细胞的诱导作用。方法:(1)分选后的CD8~+T细胞在Tc0、Tc9的极化条件下,加入或不加入TNF-α,体外培养2天后,qPCR及流式检测IL-9的mRNA及蛋白质表达情况;(2)将分选后的CD8~+T细胞在与(1)相同的培养环境下,体外培养2天后,qPCR检测Tc细胞相关的细胞因子、效应分子以及分化分子的表达情况;(3)将分选后的CD8~+T细胞在与(1)相同的的培养环境下,体外培养2天后,流式检测T细胞凋亡以及Ki67分子表达情况。结果:(1)在体外诱导Tc9细胞的过程中加入TNF-α,提高了IL-9的mRNA及蛋白质表达水平;(2)加入TNF-α后,其他Tc细胞相关的细胞因子及效应分子没有明显改变;与对照组相比,TNF-α诱导的Tc9细胞的CD44分子表达增加;(3)与常规诱导的Tc9细胞相比,TNF-α诱导的Tc9细胞的Ki67的表达量增加且Annexin V阳性Tc9细胞数降低。结论:TNF-α可以在体外环境下促进Tc9细胞的分化,提高Tc9细胞的存活能力以及增殖能力,即TNF-α对Tc9细胞具有明显的诱导作用。第二部分TNF-α对Tc9细胞的体内抗肿瘤效应的影响目的:探究TNF-α对Tc9细胞的体内抗肿瘤效应的影响。方法:(1)体外培养OT-I小鼠来源的Tc9细胞和TNF-α诱导的Tc9细胞,过继免疫治疗B16-OVA荷瘤C57BL/6小鼠,对比肿瘤的生长情况;(2)体外培养OT-I小鼠来源的Tc9细胞和TNF-α诱导的Tc9细胞,用于过继免疫治疗B16-OVA肿瘤肺转移小鼠,检测肿瘤组织中IL-9的mRNA表达情况,对比T细胞的肿瘤部位浸润情况;(3)通过体内杀伤实验,对比常规Tc9细胞和TNF-α诱导的Tc9细胞的体内特异性杀伤能力。结果:(1)相比于常规诱导的Tc9细胞,TNF-α诱导的Tc9细胞能够更有效地减缓肿瘤生长;(2)相比于常规Tc9细胞治疗组,TNF-α诱导的Tc9细胞治疗组检测到更高水平的IL-9的表达,即肿瘤部位浸润了更多的TNFα-Tc9细胞;(3)与Tc9细胞组相比,TNF-α诱导的Tc9细胞组能够更有效地特异性杀伤靶细胞。结论:TNF-α可以提高Tc9细胞的肿瘤部位浸润能力和特异性杀伤能力,增强Tc9细胞的抗肿瘤效应。第三部分TNF-α诱导Tc9细胞的作用机制研究目的:探究TNF-α诱导Tc9细胞的作用机制。方法:(1)初始CD8~+T细胞在Tc9的极化条件下,加入或不加入TNF-α以及TNF受体封闭抗体,体外培养2天后,qPCR及流式检测IL-9的mRNA及蛋白质表达情况;(2)将分选后的CD8~+T细胞在与(1)相同的培养环境下,体外培养2天后,流式检测T细胞存活以及增殖情况;(3)初始CD8~+T细胞在Tc9的极化条件下,加入或不加入TNF-α,检测STAT5、NF-κB通路相关蛋白;初始CD8~+T细胞在Tc9的极化条件下,加入或不加入TNF-α以及STAT5、NF-κB阻断剂,体外培养2天后,qPCR及流式检测IL-9的mRNA及蛋白质表达情况。结果:(1)TNF-α诱导的Tc9细胞在加入TNFR2封闭抗体后,IL-9的表达水平比加入TNFR1封闭抗体或未加入封闭抗体的实验组低;(2)加入TNFR2封闭抗体后,TNF-α诱导的Tc9细胞的凋亡水平增加,增殖能力下降;(3)TNF-α诱导的Tc9细胞的p-STAT5和p-IKKα/β分子表达量增加;应用STAT5、NF-κB封闭抗体后,TNF-α促进Tc9细胞的生成和IL-9的表达被抑制。结论:TNF-α通过结合TNFR2促进Tc9细胞分化、存活以及增殖;STAT5、NF-κB信号通路参与了TNF-α促进Tc9细胞分化的过程。