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猪繁殖与呼吸综合征是一种以临床表现为猪呼吸障碍、妊娠母猪流产或死胎和小猪高致死率为特征的传染性疾病，该病是由动脉炎病毒科的一种单股正链RNA病毒——猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的。该病毒的主要靶细胞是猪肺泡巨噬细胞(PAMs)，同时PRRSV在单核细胞、淋巴细胞等细胞中也可增殖。研究发现猪唾液酸黏附素(Sialoadhesin，Sn)和CD163共同介导着PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞，其中猪唾液酸黏附素主要在介导PRRSV病毒的黏附和内吞中发挥重要作用。有研究表明，将猪Sn(pSn)、人Sn(hSn)、小鼠Sn(mSn)与猪CD163共转染到PK-15细胞中，均可以促进PRRSV的感染，这说明三种受体在介导PRRSV感染细胞时物种间的差异并不大，提示这三个物种的Sn可能共同存在高度保守的功能结构域在介导PRRSV感染中发挥作用。 本研究通过预测猪、人和小鼠三种动物源性Sn结构域，找到了具有高度同源性的Sn保守结构域D10。同时，本实验室以前将猪Sn分为九段进行未复性蛋白的竞争结合试验和抗体封闭试验时发现，Sn6(包括结构域D9和D10)可能在PRRSV感染中发挥重要作用。因此，本研究通过大肠杆菌原核表达系统表达出猪Sn单独的结构域蛋白D9和D10，探索重组复性蛋白在PRRSV感染及抗体介导的PRRSV感染PAM细胞中的作用并与其它九段猪Sn不同片段的重组复性蛋白作对比，为进一步筛选猪Sn在PRRSV感染及抗体介导的PRRSV感染中发挥作用的功能结构域奠定基础。 本研究为研究Sn蛋白D9和D10结构域从以下四个方面开展了研究: 一、Sn受体保守结构域的同源性分析 本研究首先根据GenBank搜索出猪唾液酸黏附素受体Sn(pSn)的基因序列(GenBank:AF509585.1)、人唾液酸黏附素受体Sn((hSn)基因序列(GenBank:AF230073.1)和鼠唾液酸黏附素受体Sn的基因序列(mSn)（GenBank:NM_011426.3），然后使用SMART蛋白预测在线网站对pSn、hSn和mSn的结构域进行预测，结果显示pSn、hSn和mSn均含有一个信号肽，一个跨膜区以及18个结构域。通过MegLign软件将pSn的18个结构域同mSn、hSn的18个结构域逐个进行基因序列和氨基酸同源性分析，结果显示，pSn结构域10与mSn、hSn的同源性较高。pSn结构域10与hSn结构域11基因序列同源性为90.7％，氨基酸同源性为93.4％，与mSn结构域10基因序列同源性为83.6％，氨基酸同源性为80.3％。 二、Sn受体D9和D10结构域重组蛋白的原核表达及纯化 根据实验一不同动物源性Sn同源性分析以及pSn的基因序列(GenBank:NM_011426.3)，针对结构域D9和D10的基因序列，分别设计一对引物，以提取出的猪抗原抗体检测均为阴性的PAM细胞RNA反转录的cDNA为模板，采用RT-PCR的方法，对pSn的结构域D9和D10进行扩增，长度分别为504bp和381bp，将扩增出的D9和D10目的片段克隆到pET-32a载体中，成功得到重组表达载体质粒pET-32a-D9和pET-32a-D10。将pET-32a-D9和pET-32a-D10转化到BL21(DE3)表达菌中，以最佳的IPTG诱导表达浓度和时间大量表达重组蛋白，随后摸索最佳的尿素洗涤浓度以纯化蛋白，-40℃保存备用。 三、Sn受体D9和D10结构域重组复性蛋白在PRRSV感染中的竞争结合试验 为了探索单独的结构域D9和D10在PRRSV感染中的作用，试验三将纯化后的D9和D10重组蛋白进行了复性，同时将本实验室保存的已构建好的pSn九个片段的BL21(DE3)表达菌种重新进行了活化表达并纯化，也逐一进行了蛋白复性。本试验设置了结构域D9和D10重组复性蛋白试验组，pSn九段不同片段重组复性蛋白对照组，同时还设置了PRRSV阳性对照组和阴性对照组，收集PAM细胞（从PRRSV抗原及抗体检测均为阴性的健康仔猪肺脏中灌洗获得）铺于24孔细胞培养板中，将上述已制备好的11个pSn的重组复性蛋白使用不同的倍比稀释浓度与等体积的PRRSV病毒混合作用1h后，接种于PAM细胞。48h后，提取各孔的总RNA反转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR方法测定PRRSV的病毒拷贝数，使用GraphPad Prism5软件对得到的数据进行处理并作图分析。结果显示，高浓度的pSn不同片段、单独的结构域D9和D10与PRRSV阳性对照组相比均对PRRSV感染PAM细胞有一定的抑制作用，并且这种抑制程度与复性蛋白的浓度成正相关;虽然结构域D10的竞争结合作用比结构域D9的略好，但对比并不显著;单独的结构域D9和D10对PRRSV的抑制作用跟pSn其它片段相比差别不大。 四、Sn受体D9和D10结构域重组复性蛋白在抗体介导的PRRSV感染中的竞争结合试验 为了探索单独的结构域D9和D10在抗体介导的PRRSV感染中的作用，本试验设置了结构域D9和D10重组复性蛋白试验组，pSn九段不同片段重组复性蛋白对照组，PRRSV-IgG阳性对照组、PRRSV纯病毒对照组和阴性对照组，收集PAM细胞（从PRRSV抗原及抗体检测均为阴性的健康仔猪肺脏中灌洗获得）铺于24孔细胞培养板中，将纯化后的猪抗PRRSVIgG4倍稀释后与PRRSV病毒混合均匀后于37℃作用1h制备PRRSV-IgG感染性复合物，随后将试验三制备好的11个pSn的重组复性蛋白使用不同的倍比稀释浓度与等体积的PRRSV-IgG感染性复合物混合作用1h后，接种于PAM细胞。48h后，提取各孔的总RNA反转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR方法测定PRRSV的病毒拷贝数，使用GraphPad Prism5软件对得到的数据进行处理并作图分析。结果显示，单独的结构域D9和D10与PRRSV-IgG阳性对照组相比均对PRRSV-IgG感染性复合物感染PAM细胞有一定的抑制作用，并且这种抑制程度与复性蛋白的浓度成正相关。