第一章 FTO在多囊卵巢综合征类固醇酵激素异常中的作用研究目的多囊卵巢综合征(polycysticovary syndrome,PCOS)是一种高度复杂的生殖内分泌疾病,以高雄激素血症、月经异常和多囊卵巢为特征,约50%伴有肥胖、胰岛素抵抗等代谢异常表型。PCOS的病因复杂,多个候选基因单核苷酸多态(SNPs)和PCOS相关。其中脂肪量和肥胖相关基因(fat mass and obesity associated,FTO)是第一个全基因组关联分析发现的BMI和肥胖的易感基因,在随后研究中发现FTO多个SNPs和PCOS发病风险显著相关。本课题组在前期研究中发现FTO rs9939609A/T多态性与中国女性PCOS显著相关,不论是肥胖型PCOS或瘦型PCOS。提示FTO除影响肥胖代谢外,在女性生殖内分泌疾病中也发挥重要作用。本研究通过检测PCOS患者和对照人群颗粒细胞中FTO表达差异,进一步对颗粒细胞中FTO表达与临床分型进行关联分析,探究不同PCOS亚型中FTO的表达特点;通过构建FTO敲除和过表达的人颗粒细胞系和构建Fto特异性敲除小鼠,进一步探究FTO在类固醇激素合成代谢中的功能。方法本研究收集了 131名中国汉族女性(67例PCOS患者和64例对照)体外助孕时废弃的捐赠科研的颗粒细胞。PCOS入组条件根据鹿特丹标准,对照为由于男性因素接受体外助孕的月经规律非多囊卵巢女性。分离卵泡液中的颗粒细胞并提取RNA,通过实时定量PCR检测FTO基因的表达情况,分析FTO在PCOS组与对照组的表达差异;通过Spearman相关分析FTO表达在两组中和临床分型之间的相关性;进一步对PCOS不同亚型进行分组,分析FTO在PCOS不同亚型中的表达差异。体外功能研究中,采用CRISPR-Cas9技术和慢病毒转染技术在体外人颗粒细胞系中分别敲除和过表达FTO,通过基因组DNA PCR、实时定量PCR和Western blot技术检测敲除和过表达效率。采用CCK-8分析FTO对颗粒细胞活性的影响;采用流式细胞技术分析FTO对颗粒细胞周期、凋亡的影响;采用实时定量PCR和Western blot检测颗粒细胞分化标志基因。利用人颗粒细胞系的类固醇激素合成特点,通过电化学发光法检测颗粒细胞上清中雌激素水平;通过实时定量PCR和Western blot检测雌激素代谢关键酶SULT1E1的表达变化;通过RNA干扰技术敲降颗粒细胞中SULT1E1的表达进行拯救实验,进一步证实FTO通过调控SULT1E1的表达影响雌激素的代谢水平。根据数据库预测SULT1E1的调控因子,通过实时定量PCR和Western blot检测潜在调控SULT1E1表达的转录因子C/EBPβ的表达变化;采用染色质免疫共沉淀技术进一步证实转录因子C/EBPβ可以调控SULT1E1表达。另外,通过实时定量PCR检测雄激素受体(AR)的可变剪切变异亚型的表达变化,探究FTO的表观遗传作用在类固醇激素调控中的潜在作用。体内功能研究中,构建Fto条件性敲除(Foxl2-Cre)的小鼠验证生殖内分泌表型,同时对小鼠进行称重。采用苏木素-伊红染色观察小鼠卵巢形态和各级卵泡的变化;采用放射免疫法检测小鼠血清雌二醇、睾酮和孕酮水平,初步探究颗粒细胞中FtO对小鼠类固醇激素的影响。结果本章第一节中,通过检测PCOS患者和对照人群颗粒细胞中FTO的表达情况,发现在PCOS患者和对照人群颗粒细胞中FTO表达水平无显著差异,在对照人群颗粒细胞中发现FTO表达水平与肥胖和代谢正相关,与目前现有报道相一致。进一步对PCOS亚型分析发现,在高雄激素型PCOS颗粒细胞中FTO表达显著降低,提示FTO可能参与生殖内分泌激素的合成代谢。第二节利用人颗粒细胞系敲除和过表达FTO,发现FTO不影响颗粒细胞活性、细胞周期和细胞凋亡,但影响多个颗粒细胞分化标志基因和相关转录因子的表达(CYP19A1、C/EBPβ、FOXL2、GATA4等)。进一步检测细胞上清雌激素水平发现FTO敲除可导致上清雌激素水平显著降低。通过方法中所述的机制研究证实,一方面,FTO敲除可促进转录因子C/EBPβ的表达,进而调控下游SULT1E1表达增加,使雌激素硫化代谢能力增强,导致活性雌激素水平降低。另一方面,FTO敲除可能通过表观遗传作用影响AR可变剪切,进而影响类固醇激素的合成与代谢。第三节通过构建Fto条件性敲除(Foxl2-Cre)的小鼠,发现小鼠卵巢、垂体和下丘脑中Fto均有敲除,且Fto敲除小鼠出现体重明显降低。对21天小鼠注射PMSG44小时后取材,发现敲除小鼠的卵巢体积较小,血清雌二醇水平较低,而睾酮水平较高,提示Fto可能影响小鼠颗粒细胞类固醇激素的合成代谢。结论高雄激素型PCOS患者颗粒细胞中FTO表达呈显著降低。通过功能研究发现,FTO通过影响转录因子C/EBPβ的表达,进而调控下游SULT1E1,影响颗粒细胞雌激素合成代谢。同时FTO可能通过表观遗传作用影响AR可变剪切进一步影响类固醇激素合成代谢。综上,FTO可能通过调控类固醇合成代谢多个关键基因,参与调节生殖内分泌。第二章 烟酰胺在类固醇激素异常中的作用研究目的多囊卵巢综合征(PCOS)具有很强的临床异质性,以生殖功能障碍为主,伴有内分泌和代谢紊乱。PCOS临床高雄激素常表现为痤疮、脱发等皮肤疾病。在1型糖尿病女性中,发生高雄激素血症且合并PCOS比例高达24%。烟酰胺是一种维生素B3的衍生物,存在于日常多种食物中。目前临床用于寻常型痤疮和控制1型糖尿病发展的辅助治疗,不良反应发生较少、安全性高。目前尚未有研究报道烟酰胺在PCOS类固醇激素异常中是否具有作用。本研究将通过饥饿状态人肾上腺皮质细胞系(NCI-H295R)细胞模型探究烟酰胺对雄激素合成代谢的影响。结合转录组学分析,探究烟酰胺处理后的类固醇激素合成代谢相关基因和信号通路的改变及调控网络。初步探究烟酰胺在PCOS类固醇激素异常中可能的作用。方法本研究采用饥饿状态的NCI-H295R作为研究雄激素合成代谢的模型,用不同浓度(1mM、5mM和25mM)烟酰胺处理细胞。采用CCK-8检测不同浓度烟酰胺对细胞活性的影响;收集细胞上清检测睾酮水平,并通过细胞蛋白含量进行均一化校正。采用25mM烟酰胺处理细胞,进行转录组学测序分析烟酰胺对雄激素作用的潜在分子靶标。采用实时定量PCR进行差异基因验证;采用聚类分析和主成分分析对烟酰胺处理细胞后的差异基因(差异倍数>2,FDR<0.01)进行聚类降维;采用GSEA分析对所有调控基因进行基因集富集分析;采用KEGG分析和GO分析对差异基因进行富集通路分析;采用STRING数据库分析差异基因关键通路上的蛋白-蛋白互作网络。结果本研究发现25 mM烟酰胺可以有效抑制细胞活性。检测细胞培养液上清中的睾酮水平(蛋白含量均一化)发现,烟酰胺能抑制NCI-H295R细胞产生睾酮,呈剂量依赖性。采用25mM烟酰胺进行后续转录组学分析发现,烟酰胺处理后共有2835个显著变化的差异基因(差异倍数>2,FDR<0.01),其中1631个基因显著上调,1204个基因显著下调。多个类固醇激素合成代谢相关的基因(SULT2A1、AKR1C3、IGF1、CYP11A1、CYP17A1、HSD3β2 等)表达显著下调。GSEA 分析显示多个基因集有显著改变,包括E2F靶基因集、TGFβ信号通路基因集、雄激素反应基因集、雌激素反应基因集、IGF1和IGF2靶基因集、类固醇激素合成基因集、细胞周期基因集、有丝分裂相关通路基因集、类固醇脱氢酶活性基因集和排卵周期基因集。KEGG分析显示差异基因显著富集在TGFβ信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作和卵巢类固醇合成通路。GO分析差异基因发现生物学过程主要富集在细胞增殖和分化、SMAD蛋白信号转导和细胞激素代谢过程。分子功能方面主要富集在RNA结合和含蛋白复合物的细胞成分。蛋白-蛋白互作分析结果显示类固醇激素合成、TGFβ信号通路和细胞增殖这几个通路上的差异基因编码的蛋白直接存在许多密切的互作关系。结论该研究发现烟酰胺在较高浓度会抑制雄激素合成。一方面,雄激素合成途径中多个关键酶(如AKR1C3、CYP11A1、CYP17A1和HSD3β2等)发生变化进而抑制雄激素合成。另一方面,细胞周期、细胞增殖和激素合成相关等多个信号通路在差异基因中富集,烟酰胺可能影响这些通路从而调控雄激素合成代谢。这些发现不仅可以解释烟酰胺治疗痤疮的机制,同时为烟酰胺作为PCOS高雄激素血症的辅助替代药物治疗提供了理论依据。