南极酵母Pseudozyma sp.JCC207海藻糖基因及其适应南极极端环境分子机制研究

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海藻糖是生物体中一种重要的非还原糖,对生物体组织和生物大分子具有非特异性保护作用,逐渐成为备受关注的天然物质。海藻糖具有在冻结、干燥、高渗透压等这类严酷的环境下,保护生物体膜、膜蛋白、DNA等的功效,使生物在极端环境中更容易存活,可见,海藻糖是生物体中重要的功能物质。南极酵母是指生活在南极海冰、海冰边缘或海水等极端环境中一大类酵母的总称,是南极主要的真菌生物。南极酵母长期在低温、高盐环境中生长和繁殖,海藻糖基因及海藻糖发挥了重要功能。南极酵母海藻糖合成酶指导合成海藻糖是其适应南极极端环境的重要生存机制,因此从分子水平上研究南极酵母的海藻糖产生机制是非常有必要的。南极酵母Pseudozyma sp.JCC207是南极酵母里具有代表性的一株菌,对它海藻糖形成机制研究可以为南极生境和其他物种的研究提供理论基础。  本论文主要进行了以下研究内容:1)南极酵母Pseudozyma sp.JCC207的全基因组测序;2)普通PCR法克隆获得南极酵母Pseudozyma sp.JCC207基因TPS1并对TPS1、TPS2进行了生物信息学分析;3)应用实时定量PCR技术对南极酵母Pseudozyma sp.JCC207 TPS1的转录调控机制进行了研究;4)通过单因素实验法优化了南极酵母Pseudozyma sp.JCC207的培养条件;5)通过单因素实验、Box-Behnkens设计和响应面分析法对三氯乙酸法提取海藻糖的提取条件进行了优化,建立了影响因素的二次回归方程;6)通过添加不同浓度海藻糖与甘油、二甲基亚砜保种试剂对比,探究海藻糖对南极酵母Pseudozyma sp.JCC207保种的作用。  全基因组测序得到了南极酵母Pseudozyma sp.JCC207全部基因,其中包含了本实验所需的TPS1、TPS2基因;克隆得到南极酵母Pseudozyma sp.JCC207TPS1基因ORF全长1827bp,编码蛋白608个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为64.46 Da;测序得到TPS2基因ORF全长3963 bp,编码蛋白1321个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为144.47 KDa;qRT-PCR结果显示,在高盐和低温条件下TPS1表达量高,说明,TPS1对高盐和低温敏感;单因素试验优化得到南极酵母最适培养温度为25℃,pH为5~9范围内酵母生长情况差别不大;响应面分析得到三氯乙酸法提取海藻糖的最佳条件为三氯乙酸浓度0.6mol/L、体积15.16mL、提取时间29.76min,经验证,优化条件下的海藻糖提取量与理论预测值基本吻合;海藻糖保种实验中,功能试验表明,与甘油(20%)和二甲基亚砜(10%)等传统保种试剂相比,0.5%海藻糖溶液在短期内(5d)对酵母具有更好的保种能力。
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