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背景及目的戊二酸尿症Ⅰ型是戊二酰辅酶A脱氢酶基因突变引起的一种罕见常染色体隐性遗传性神经退行性疾病。戊二酰辅酶A脱氢酶基因突变导致戊二酰辅酶A脱氢酶缺乏,导致赖氨酸、羟赖氨酸和色氨酸代谢途径受阻,中间代谢产物戊二酸、3-羟基戊二酸、戊烯二酸在组织和体液内蓄积,诱发一系列神经系统损害。患儿常于生后3-36个月,因非特异性疾病诱发急性脑病危象,导致不可逆的急性纹状体变性和皮质损害。临床上表现为大头畸形,进行性肌张力异常,运动障碍,共济失调和癫痫发作等。影像学可见额颞叶皮质萎缩、脑白质病、基底神经节变性、脑外间隙及大脑侧裂池增宽。病理学上戊二酸尿症Ⅰ型最显著特征是纹状体神经元减少。戊二酸尿症Ⅰ型纹状体退行性变的发病机制研究主要集中在兴奋性毒性损伤、能量代谢耗竭及氧化应激损伤三个方面。戊二酸和3-羟基戊二酸通过N-甲基-D-天冬氨酸受体介导兴奋性毒性损伤,戊二酸、3-羟基戊二酸和戊二酰辅酶A干扰三羧酸循环导致能量代谢障碍,导致神经元损伤。大脑具有极高耗氧量,可氧化不饱和脂肪酸含量高,且抗氧化防御系统活性较低,神经系统对氧化应激高度敏感。维生素E是细胞膜内重要的抗氧化物和膜稳定剂,能有效阻止脂质过氧化。α-生育酚是主要的内源性亲脂性天然抗氧化剂,是维生素E最具生物活性的形式,作为过氧自由基清除剂,具有神经保护作用。本课题组采用前期构建GCDH-/-大鼠为研究模型,通过高赖氨酸饮食诱导戊二酸尿症Ⅰ型疾病状态大鼠模型。灌胃给予α-生育酚对模型大鼠进行干预,观察各组大鼠一般情况(体重和生存能力),HE染色观察各组大鼠额颞叶皮质、纹状体病理形态学改变,ELISA法检测额颞叶皮质、纹状体氧化应激指标丙二醛(Malondialdehyde,MDA),抗氧化酶防御体系谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)、微量还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的变化,蛋白免疫印迹法检测额颞叶皮质、纹状体丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)通路中细胞外调节蛋白激酶(Extracellular Regulated protein Kinase,ERK)、c-Jun 氨基端激酶(c-Jun-NH2-terminal kinase,JNK)和 p38 MAPK的蛋白表达水平。从动物模型水平探讨戊二酸尿症I型氧化应激损伤及可能通路,以及经典抗氧化剂α-生育酚对高赖氨酸饮食GCDH-/-大鼠氧化应激损伤的保护机制。本研究为戊二酸尿症Ⅰ型提供了近似机体疾病状态的研究模型,也为研究戊二酸尿症Ⅰ型潜在病理生理机制、探索临床治疗方案提供了实验基础。方法1.本研究基于课题组前期构建的GCDH-/+大鼠模型,雌雄3:1配种繁殖,仔鼠基因型鉴定,获得纯合子大鼠(GCDH-/-)36只、野生型大鼠(GCDH+/+)21只。2.确定基因型的子代大鼠随机分为6组:野生型标准饮食组(A1)、纯合子标准饮食组(B1)、野生型高赖氨酸饮食组(A2)、纯合子高赖氨酸饮食组(B2)、野生型高赖氨酸饮食+α-生育酚组(A3)、纯合子高赖氨酸饮食+α-生育酚组(B3)。3.4周龄,A1组和B1组给予标准饮食,A2组、B2组、A3组和B3组给予4.7%赖氨酸饮食,自由进食水,A3组和B3组每天上午10点以100 mg/kg.d的剂量灌胃给予α-生育酚1次。按照不同分组处理28天后留取标本。每天测量体重,以三次测量均数为当天体重。4.HE染色观察额颞叶皮质、纹状体病理形态学改变;ELISA法检测额颞叶皮质、纹状体组织氧化应激指标变化;western blot法检测MAPK通路JNK、P38、ERK蛋白表达情况。结果1.基因型鉴定:子代可出现GCDH-/-、GCDH-/+和野生型SD大鼠三种基因型。野生型(GCDH+/+)转录产物电泳出现725 bp一条带(WT引物扩增),纯合子(GCDH-/-)出现498 bp一条带(GT引物扩增),杂合子(GCDH-/+)两条带同时出现。2.各组鼠一般情况及存活率分析:饮食及药物干预第7天B2组2只大鼠出现步态异常主要包括头部向左倾斜,前肢瘫软,干预第15天B3组1只大鼠出现头部向左倾斜。B2组死亡4只,存活率为69.23%(9/13),B3组死亡1只,存活率为91.67%(11/12)。A1组、B1组、A2组和A3组大鼠一般情况良好,存活率100.00%。3.各组鼠饮食及药物干预不同时间体重变化:饮食及药物干预前(0天)6组之间体重无明显差异。饮食及药物干预7天后,随着干预时间延长,B2组和B3组大鼠体重较其他分组均明显减轻,且B2组大鼠体重显著减轻。4.各组鼠脑组织病理形态学改变:B2组额颞叶皮质、纹状体神经元细胞固缩深染,胞质与胞核分界不清,细胞形状不规则,间质水肿,细胞排列紊乱。B3组额颞叶皮质少量神经元细胞固缩深染,细胞形状较规则;纹状体神经元细胞排列规则,分界清晰;其余各组未见明显异常。5.氧化应激指标:与A1组比较,B2组额颞叶皮质、纹状体MDA显著增加,GSH显著减少,GPx、CAT、SOD活性显著减弱。与B2组比较,B3组额颞叶皮质、纹状体MDA显著减少,抗氧化酶恢复部分活性。6.MAPK通路中JNK、P38、ERK蛋白表达情况:western blot结果显示,与A1组比较,B2组额颞叶皮质P38蛋白表达水平显著上调,纹状体JNK、P38蛋白表达水平显著上调。与B2组比较,B3组额颞叶皮质、纹状体JNK、P38蛋白表达水平均显著下调。结论1.高赖氨酸饮食GCDH-/-大鼠出现氧化应激损伤,造成神经系统损害。2.高赖氨酸饮食GCDH-/-大鼠氧化应激激活P38、JNK通路,启动MAPK信号通路,参与GAⅠ神经损伤。3.α-生育酚减轻氧化应激损伤,对GCDH-/-大鼠起神经保护作用。