1研究目的1-溴丙烷(1-Bromopopane,1-BP),又称正丙基溴,溴代正丙烷或溴正丙烷,无色液体,有刺激性气味,易挥发,不易燃,在大气中半衰期短,不破坏大气臭氧层,是一种工业用有机溶剂。根据蒙特利尔草案,全球已经逐步停止了臭氧层消耗剂含氯氟烃(hydro chlorofluorocarbons,HCFCs)的生产和消耗。1-BP被USEPA新替代物政策项目选为HCFCs的替代物,主要用作精密仪器清洗剂、喷雾粘合剂和冷浴去脂剂。然而,随着1-BP使用量的增加,对其毒性的研究报道也越来越多,其对接触人群的潜在危害不容忽视。近年来的报道显示1-BP有多种毒性,包括肝脏毒性、神经毒性、发育毒性,致癌等,其中中枢神经毒性是1-BP最早出现的也是最复杂的毒性,但目前1-BP中枢神经毒性机制的研究还未完全阐明,临床上亦缺乏特效治疗药物。NMDA受体是谷氨酸的离子型受体,与学习记忆和突触的可塑性密切相关。MK-801是NMDA受体的非竞争性拮抗剂,有研究显MK-801能够阻止因NMDA激活造成的Ca2+超载,以及其他的一系列变化所带来的神经元损伤。先前研究观察到1-BP能引起海马DG区兴奋性增高,研究者推测是因NMDA受体过度激活所致。另外研究显示,慢性吸入1-BP激活大脑MAPK通路,推测也可能与NMDA受体激活有关。但是NMDA受体与1-BP中枢神经毒性之间确切的关系尚未见文献报道。因此,本研究第一部分实验采用MK80作为干预剂,观察N-MDA受体在1-BP中枢神经毒性中的作用;并根据第一部分实验中1-BP染毒后动物大脑中的神经递质含量的分析发现1-BP染毒组大鼠大脑皮层和海马中牛磺酸显著降低,因此第二部分实验选取了牛磺酸作为干预,从氧化应激,凋亡等方面研究补充牛磺酸是否具有保护作用及其机制,为1-BP的神经毒性的预防以及治疗提供理论参考数据。2研究方法1.MK801对1-BP致大鼠中枢神经系统毒性的保护作用及机制1.1动物处理48只雄性SPF级Wistar大鼠按照体重随机分为4组(n=12),分别是空白对照组、1-BP染毒组、MK-801+1-BP干预组、MK-801单独对照组。动物适应性喂养5天后开始给药,其中1-BP经玉米油溶解稀释,经口染毒,剂量为800mg/kg.bw;MK-801溶于生理盐水,在1-BP染毒前一个小时腹腔注射给药,剂量为0.1mg/kg.bw,空白对照组给予等体积的玉米油和腹腔注射等体积的生理盐水,MK801对照组给予0.1mg/kg.bw MK801腹腔注射和等体积玉米油灌胃,连续实验14天。1.2水迷宫实验实验第14天到第20天,每组所有动物分别进行Morris水迷宫实验1.3组织病理水迷宫实验结束后,每组选取4只大鼠用10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛经心脏灌注,迅速剥离大脑,放于4%多聚甲醛中进行后固定48小时,转移至30%蔗糖溶液中沉底后,在冰冻切片机上制备厚度为40um的脑片,分别进行硫堇染色,NeuN染色和Iba-1染色,观察神经元的形态和小胶质细胞形态。1.4高效液相色谱法测定大鼠大脑内氨基酸类神经递质的含量,准确称取各组大鼠大脑皮层和海马(n=5),按照质量:体积=1:9,用50%甲醇的水溶液匀浆,12000g低温离心10min后取上清,将上清再次12000g离心10min后取上清。配置L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸、牛磺酸的标准溶液。用移液枪分别吸取混合标准溶液/待测样品匀浆液150ul,0.5mol/LNaHCO3溶液100ul,0.5%NFB-D(2,4-二硝基氟苯)溶液50ul于1.5ml的EP管内,混匀,65℃水浴中暗反应55min,精确控制水温和反应时间。反应结束后取出,冷却至室温,用0.22um的水系滤膜过滤反应液,置于液相进样瓶中待用,设置仪器参数进行测定。1.5谷氨酰胺含量用谷氨酰胺试剂盒进行测定。1.6 Western Blotting检测大鼠大脑NMDA受体亚基以及炎症相关蛋白的表达。水迷宫实验结束后,处死大鼠,快速分离大鼠大脑皮层和海马,用RIPA裂解液制备组织匀浆,采用Western Blotting检测大鼠皮层和海马中NMDA受体亚基NR2A,NR2B的表达,以及炎症相关蛋白NLRP3,IL-1β,caspase-1的表达。2.牛磺酸对1-BP致大鼠中枢神经毒性的保护作用及机制2.1动物处理SPF级成年雄性Wistar大鼠60只,适应性喂养5天后,按照体重随机分成4组(n=12),分别是空白对照组、1-BP染毒组、牛磺酸100mg/kg+1-BP组、牛磺酸200mg/kg+1-BP组、牛磺酸对照组。1-BP用玉米油溶解,剂量为800mg/kg,经口染毒;牛磺酸用双蒸水溶解,在1-BP染毒前一个小时经口分别给予牛磺酸1OOmg/kg+1-BP组、牛磺酸200mg/kg+1-BP组和牛磺酸对照组动物,空白对照组给予等体积的玉米油,牛磺酸对照组给予200mg/kg牛磺酸,连续14d。2.2水迷宫实验实验第14d到第20天,每组所有动物分别进行Morris水迷宫实验。2.3各组大鼠大脑MDA水平的检测按照质量:体积=1:9用PBS匀浆脑组织,低温1600g离心10分钟取上清,用MDA试剂盒进行检测。2.4高效液相色谱测定大鼠大脑皮层和海马中牛磺酸的含量,方法同1.42.5 Western Blotting水迷宫实验结束后,处死大鼠,分离大鼠大脑皮层和海马,用配置好的RIPA裂解液制备组织匀浆,采用Western Blotting检测大鼠皮层和海马中线粒体复合蛋白 I-V、ASK1、P-ASK1、P38MAPK、P-P38MAPK、Bc1-2、BAX、caspase-3以及 cleaved-caspase3 的表达。3研究结果3.1 MK801对1-BP大鼠中枢神经系统毒性的保护作用及机制3.1.1MK-801对1-BP致大鼠学习记忆能力损伤的影响空间探索实验中,随时间增加,各组大鼠逃避潜伏期均呈逐渐缩短趋势。与对照组相比,1-BP染毒组逃避潜伏期延长,游泳总距离明显增加,差异均具有统计学意义(尸<0.05);MK-801干预组与染毒组相比,逃避潜伏期和游泳总路程减少,差异有统计学意义(P<0.05)。定位航行实验中,与对照组相比,1-BP染毒组穿越平台次数明显降低(尸<0.01),而MK-801干预组与对照相比没有差异(尸>0.05)。实验过程中,各组大鼠的游泳速度无统计学差异(尸>0.05),可排除运动能力受损对实验结果的影响。3.1.2 MK801对1-BP染毒大鼠大脑皮层和海马组织、病理形态的影响硫堇染色中,1-BP染毒组大脑皮层中的神经细胞染色变浅,可观察到空泡形态细胞,海马CA1区以及CA3区细胞边界不清,形态皱缩,给予MK-801干预能明显改善神经细胞的形态。NeuN染色神经细胞计数结果显示,1-BP染毒组大鼠海马CA1区和CA3区NeuN阳性细胞数目与对照组相比,分别减少了 24.9%和31.7%(P<0.01)。而MK801干预组的CA1区和CA3区细胞数目与染毒组相比上升(尸<0.01)。3.1.3 MK801对1-BP染毒大脑中氨基酸类神经递质含量的影响1-BP染毒组与对照组相比较,天门冬氨酸在皮层和海马中均升高(P<0.01),牛磺酸在海马和皮层中均降低(P<0.01),甘氨酸在海马和皮层中均升高(尸<0.01),谷氨酸没有明显变化,GABA在皮层和海马中均降低,但只在海马中有统计学意义(尸<0.05)。给予MK-801干预后,海马和皮层中甘氨酸以及天门冬氨酸的量与1-BP染毒组相比,明显降低,差异具有统计学意义(尸<0.01)。3.1.4 1-BP染毒对大鼠大脑中谷氨酰胺的影响大脑皮层中,1-BP染毒组与对照组相比,谷氨酰胺含量上升了 20.1%(尸<0.05),而MK801干预组与1-BP组相比,谷氨酰胺降低了 16.3%(尸<0.05);海马中,1-BP染毒组与对照组相比,谷氨酰胺含量上升了 27.3%(P<0.01),而MK801干预组与1-BP组相比,谷氨酰胺降低了 18.2%(尸<0.05)。3.1.5 MK801对1-BP染毒大鼠大脑NMDA受体亚基表达变化的影响1-BP染毒组与对照组相比,NR2A和NR2B在大脑皮层和海马中均降低(尸<0.01)。给予MK801干预后,与1-BP组相比,NR2A和NR2B均升高(P<0.01)。3.1.6 MK801对1-BP染毒大鼠大脑炎性反应的影响小胶质细胞免疫组化染色显示,1-BP染毒组小胶质细胞胞体增大,分支增多,呈现“阿米巴”样改变。各组小胶质细胞计数无统计学差异(尸>0.05);对染色细胞进行积分光密度分析,1-BP组与对照组相比,大脑皮层、CA1和CA3区中小胶质细胞染色的积分光密度分别增加了 55.2%、52.7%和59..3%(P<0.01)。给予MK801干预后,与1-BP组相比,小胶质细胞染色的积分光密度显著降低(尸<0.01)。此外,采用蛋白电泳检测了炎性相关蛋白NLRP-3、IL-1β、caspase-1的表达,1-BP组与对照组相比,大脑皮层和海马中NLRP-3、IL-1β、活化的caspase-1表达均明显升高(尸<0.01)。给予MK801干预后,与1-BP组相比,NLRP-3、IL-1β、活化的 caspase-1 表达降低(P<0.01)。3.2牛磺酸对1-BP致大鼠中枢神经毒性的保护作用及机制3.2.1牛磺酸对1-BP染毒引起大鼠的学习记忆损伤的影响空间探索实验中,随时间增加各组大鼠逃避潜伏期均呈逐渐缩短趋势。与对照组相比,1-BP染毒组逃避潜伏期延长,游泳总距离明显增加,差异均具有统计学意义(尸<0.01)。定位航行实验中,与对照组相比,1-BP染毒组穿越平台次数明显降低(尸<0.01),而牛磺酸干预组与1-BP染毒组相比,穿越平台次数增加(尸<0.01),说明1-BP损伤了大鼠的空间记忆能力,而牛磺酸能够明显改善1-BP导致的大鼠空间学习记忆损伤。实验中,各组大鼠的游泳速度无差异,排除运动能力损伤对游泳的影响。3.2.2牛磺酸对1-BP染毒大鼠大脑组织病理形态的影响大鼠大脑皮层的神经元硫堇染色中,1-BP染毒组的神经细胞染色变浅,有空泡形态的细胞。海马CA1区和CA3区染色中,1-BP染毒组细胞边界不清,形态皱缩,给予牛磺酸干预后动物神经细胞形态趋于正常。NeuN染色及细胞计数表明,1-BP染毒组大鼠与对照组相比,皮层神经细胞计数降低了 37.5%(P<0.01),而牛磺酸干预低剂量组和高剂量组与1-BP染毒组相比,细胞计数分别升高了33.6%,37.1%(P<0.01);1-BP染毒组大鼠与对照组相比,海马CA1和CA3区神经细胞计数分别降低了 30.2%,33.1%(P<0.01),而牛磺酸干预低剂量组和高剂量组与1-BP染毒组相比,CA1细胞计数分别升高了 24.5%,27.7%,CA3分别升高了 29.3%,32.4%(尸<0.01)。3.2.3各组大鼠大脑MDA的含量大脑皮层中,1-BP染毒组MDA含量与对照组相比,升高了 24.8%(P<0.05);与1-BP染毒组相比,牛磺酸低剂量组和高剂量组MDA含量分别降低了 21.0%,21.3%(P<0.05)。海马中,1-BP染毒组MDA含量与对照组相比,升高了 20.1%(P<0.05);与1-BP染毒组相比,牛磺酸低剂量组和高剂量组MDA含量分别降低了 8.3%,32.4%(P<0.05)。3.2.4高效液相色谱法检测各组大鼠皮层和海马牛磺酸的含量皮层和海马中,1-BP染毒组与对照组相比牛磺酸含量分别降低了 43.1%,40.1%(P<0.01)。给予牛磺酸干预后,大脑皮层和海马中的牛磺酸含均升高,且有剂量反应关系。低剂量磺酸干预组大鼠大脑皮层和海马中牛磺酸含量较1-BP染毒组分别升高了 42.5%,50.1%(P<0.01);高剂量牛磺酸干预组大脑皮层和海马中牛磺酸含量较1-BP组分别升高了 57.3%,57.6%(P<0.01)。3.2.5牛磺酸对大脑中线粒体复合蛋白表达的影响大鼠大脑皮层中,1-BP染毒组粒体复合体蛋白I-V表达与对照组相比均明显下降,其中I-IV蛋白表达的差异有统计学意义(P<0.05),蛋白V的表达没有统计学意义(P>0.05),同时给予不同剂量的牛磺酸时,线粒体复合体蛋白I-IV的表达均有不同程度的恢复,各剂量组差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,1-BP染毒组海马中线粒体I-V均有不同程度的下降,其中线粒体蛋白I和IV与对照组相比有统计学意义(P<0.05),同样给予牛磺酸时,线粒体复合蛋白有不同程度的恢复。3.2.6牛磺酸对ASK1/P38MAPK蛋白表达的影响在大脑皮层和海马中,1-BP染毒组与对照组相比,P-ASK1分别升高了 51.6%,40.9%(P0.01),P-P38 分别升高了 46.9%,37.5%(P<0.01)。给予牛磺酸干预后,降低了大脑皮层和海马中P-ASK1和P-P38的表达,差异具有统计学意义(P<0.01)。3.2.7牛磺酸对凋亡相关蛋白的影响大脑皮层中,1-BP染毒组与对照组相比,Bc1-2降低了 33.3%(P<0.01),BAX 增加了 21.1%(P<0.05),BAX/Bc1-2 比值升高了 48.5%(P<0.01)。在海马中,1-BP染毒组与对照组相比,Bc1-2降低了 33.9%(P<0.01),BAX增加了11.4%,BAX/Bc1-2比值升高了 38.9%(P<0.01)。给予牛磺酸干预后,与染毒组相比,大脑皮层和海马中Bc1-2升高,BAX降低(尸<0.05)。大脑皮层和海马中,1-BP染毒组与对照组相比,caspase-3降低,但无统计学差异,活化的caspase-3分别升高了 55.0%,25%(P<0.01);cleavead-caspase-3/caspase3 分别升高了 57.3%,28.2%(P<0.01)。给予牛磺酸干预后,与染毒组相比,大脑皮层和海马中活化的caspase-3均降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。4研究结论1.1-BP染毒导致大鼠脑内兴奋性氨基酸升高,抑制性氨基酸降低,引起大脑兴奋效应,NMDA受体敏感性增加,另一方面,NMDA受体NR2A和NR2B功能亚基表达下调,引起学习记忆功能损伤。1-BP染毒引起大脑皮层和海马小胶质细胞的活化,炎症因子表达增加,给予MK801干预后,改善了大鼠学习记忆功能,纠正NR2A和NR2B功能亚基表达异常,明显减轻小胶质的活化以及炎症因子的表达。2.牛磺酸可显著改善大鼠大脑中牛磺酸的降低,拮抗1-BP染毒引起的中枢神经系统氧化损伤,以及通过ASK/P38通路改善1-BP引起的大鼠大脑细胞凋亡,从而显著改善1-BP染毒引起的认知损伤。