茎点霉Phoma活性及检疫性茎点霉小分子多肽检测技术研究

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检疫性Phoma寄主范围极为广泛,危害豆科、十字花科、茄科等几十个属的上百种植物,能侵染寄主各个部位。导致作物产量下降、品质降低,甚至死亡,造成巨大的经济损失。本文在深入研究了茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)、豌豆茎点霉(Phoma pinodes)、豌豆脚腐病菌(P.pinodella),葡萄茎枯病菌(P.glomerata)等12个种共21个菌株的生物学特性基础上,重点对Phoma孢子活性染色方法和P.pinodella、P.glomerata、P.terrestris、P.tracheiphila四种Phoma检疫性代表种小分子多肽的检测鉴定方法进行了研究,探索出Phoma孢子活性染色方法及检疫性Phoma小分子多肽检测方法,研究结果如下:Phoma属12个种21个菌株的生物学特性研究表明,Phoma菌株在菌落形态、生长速度、产孢等方面有显著差异,其中检疫性豌豆脚腐病菌(P.pinodella)种内菌落形态也有较大差异,菌落圆形,白色、棕色、红棕色,部分呈浅黄色、黑色和墨绿色等。分生孢子单孢、无色或浅绿色,透明、薄壁,球形、椭圆形或长杆状,部分梨形,少量菌株孢子有一个或两个油球。分生孢子器球形、近球形,外壁呈黑色或褐色。通过孢子萌发时间、致死温度、活性染色所需染料种类、浓度、染色时间等条件的筛选,确定了P.glomerata、P.errestris 2种检疫性茎点霉的孢子致死温度为52℃和50℃。根据碘化丙啶染料使死细胞与活细胞在不同波长激光光源激发下产生的荧光强度不同,筛选出使用浓度为1mg/ml的PI染液能够明显区分死孢子和活孢子。建立Phoma的孢子活性检测方法,并对该方法进行了重复性验证。以PD液体培养五天的P.glomerata、P.pinodella、P.terrestris、P.tracheiphila四个代表种用匀浆+SDT裂解法提取蛋白后,进行iTRAQ分析,确定了四种检疫性Phoma真菌种的差异蛋白。以筛选标准Ratio>2且P<0.05,删除预测蛋白,筛选出四组样品中特异性表达蛋白数目分别为33、17、41、16种。其中差异显著的蛋白主要为葡萄茎枯病菌株中的Dipeptidyl-peptidase 5、50S ribosomal protein L6、Scytalone dehydratase、Methylthio-ribulose-1-phosphate dehydratase、1,3,6,8-tetrahyd roxynaphthalene reductase蛋白;豌豆脚腐病菌株中的Diaminopropionate ammonialyase、SURF-family protein Shy1、Ankyrin repeat and SAM domain containing protein 6、Conidial yellow pigment biosynthesis polyketide synthase、3’-phosphoadenosine 5’-phosphatase isoform A、Mycocerosic acid synthase蛋白;大葱抗粉根病菌株中的Translationally-controlled tumor protein、ATP-dependent RNA helicase DBP5、Acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex、Probable Xaa-Pro aminopeptidase PEPP、Delta(12)fatty acid desaturase蛋白;维管束茎点霉菌株中的Synaptic glycoprotein SC2、Chitooligosaccha ride deacetylase、Thiosulfate sulfurtransferase、Aldehyde dehydrogenase、Polyadenylatebinding protein 2(Poly(A)-binding protein 2)蛋白。
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