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目的：本研究通过探讨健脾益气补髓方对实验性自身免疫性重症肌无力大鼠的线粒体融合与分裂作用相关调控蛋白 Mfn1/2、Opa1、Drp1和 Fis1机制的影响，同时对健脾益气补髓方及其药味对乙酰胆碱酯酶抑制活性进行测试研究，基于能量代谢的角度及针对重症肌无力主要“靶点”的对症治疗方面，阐释了健脾益气补髓法治疗重症肌无力的作用机制，并对健脾益气补髓方进行内在质量评价，为保证稳定的临床疗效提供科学依据。
方法：1、用注射免疫抗原的主动免疫方式建立实验性自身免疫性重症肌无力大鼠模型（EAMG），通过观察临床症状、体重变化及检测模型大鼠外周血乙酰胆碱受体抗体（ AchR-ab）水平，评价健脾益气补髓方对实验性自身免疫性重症肌无力动物模型的影响。
2、取健脾益气补髓方高、中、低剂量组，阳性药组（强的松组），模型组等各组大鼠腓肠肌组织标本，通过标本固定、脱水、石蜡包埋和制片、脱蜡和水化、抗原修复、标本固定、血清封闭、一抗和二抗孵育、DAB显色、复染、封片，按照免疫组织化学实验方法流程操作，NIS-ELEMNT BR图像分析系统加载生成的图像，采用显微镜观察及图像分析系统测量蛋白表达的平均光密度值，统计分析实验各组别腓肠肌组织中 Mfn1，Mfn2，Opa1，Drp1，Fis1五个线粒体融合与分裂作用相关调控蛋白表达的差异。
3、取上述实验各组大鼠脾脏、胸腺及腓肠肌，HE染色，图像分析系统检视分析组织学病理形态学，并对腓肠肌中肌纤维横截面积进行测定。
4、采用 Ellman法对健脾益气补髓方药及其中药味对乙酰胆碱酯酶抑制活性进行测试研究，同时进行有效成分与药效活性进行相关项研究。
5、采用液质联用技术、HPLC-ELSD指纹图谱分析和多组分定量分析对本方药物质基础进行多方位质量评价研究。
结果：1.模型建立：首次免疫后45天进行第2次加强免疫， EAMG模型大鼠症状进一步加重，出现呼吸急促，颤抖进一步剧烈，无法抬颈，头部紧贴台面，触及上颌，与正常对照组相比体重进一步减轻， EAMG组大鼠外周血清中AchR-ab分泌水平明显升高，二者具有显著性差异（p＜0.0001）。
2.EAMG体重及症状：与 EAMG组大鼠比较，中药高、中、低剂量组大鼠，从给药20天开始，各剂量组大鼠体重增加较 EAMG组具有统计学差异（ p＜0.01），表明健脾益气补髓方改善 EAMG体重及临床症状。
3.EAMG外周血清中 AchR-ab抗体水平：EAMG组在整个灌胃期间直至结束，大鼠外周血清抗体水平始终高于对照组。与 EAMG相比较，中药各剂量组大鼠外周血清 AchR-ab水平明显降低，中药高剂量组与强的松组相比， EAMG外周血清 AchR-ab水平降低程度相当，未见明显差异（p=0.22＞0.05）。
4.调节线粒体融合与分裂的蛋白的表达水平实验结果：使线粒体处于稳态的五个蛋白 Mfn1，Mfn2，Opa1，Drp1，Fis1免疫组化的表达水平研究结果表明，标记阳性蛋白呈棕黄色或浅黄色，阴性未见黄色蛋白显示。其中对照组相关蛋白表达量较高，阳性程度较高，分布面积较大，造模后动物肌肉中线粒体动力学相关蛋白表达显著下降，模型组中五种相关蛋白表达量减少，比较对照组，表达强度降低（P＜0.01）；给予健脾益气补髓方药后，线粒体中五种蛋白表达上调，使线粒体融合分裂重回动态平衡，维持线粒体的形态结构及生物合成的稳定，保障线粒体的稳定发挥，促进线粒体功能机制的恢复。
5.健脾益气补髓方对免疫器官病理组织学形态学影响结果：脾脏正常组，脾脏内含大量淋巴组织，脾脏实质分红髓、白髓及边缘区三部分；白髓主要由淋巴细胞密集的淋巴组织构成，其又可分为动脉周围淋巴鞘和淋巴小结两部分。动脉周围淋巴鞘由大量 T细胞和少量巨噬细胞与交错突细胞等构成。淋巴小结由大量 B细胞构成；空白对照组脾脏结构未见异常，未见明显的生发中心。模型组脾脏呈萎缩状，其内淋巴细胞含量明显减少，白髓内动脉周围淋巴鞘和淋巴小结残存或几乎消失，红髓内细胞成分显著减少，可见大量含铁血黄素分布，脾脏储血及造血功能严重破坏。健脾益气补髓方与阳性药给药组中，脾脏中白髓内动脉周围淋巴鞘和淋巴小结面积可见不同程度增加，高中剂量组中白髓成分增加较多，阳性药物与低剂量组中白髓成分呈增加趋势，整体红髓功能改善，增加储血及造血功能。
胸腺属于中枢淋巴器官，是淋巴细胞早期分化的场所。淋巴干细胞在其内分裂、分化，能过连续不断地向周围淋巴器官及淋巴组织输送处女型淋巴细胞。胸腺表面的被膜薄层结缔组织伸入胸腺实质形成小叶间隔，分隔胸腺形成胸腺小叶，每个小叶分为皮质和髓质两部分，皮质内胸腺细胞密集，染色较深，髓质中含较多的上皮细胞，染色较浅。正常对照组：胸腺组织内皮质和髓质染色清晰，皮质内富含胸腺细胞，是 T细胞的前身；髓质内含较多胸腺上皮细胞，偶见胸腺小体。模型组胸腺呈萎缩状，细胞成分明显减少，髓质内淋巴细胞分化障碍，凋亡细胞成分增多，可成星空状。皮质成分减少，明显变薄。提供胸腺功能障碍。阳性药物组和给药组中，胸腺中髓质中细胞凋亡形成的星空现象明显减少，增加皮质和髓质细胞成分，增加胸腺功能，其中高中剂量增加胸腺中细胞成分的作用较好，阳性药物组与低剂量组效果相接近。
腓肠肌肌肉组织：正常组肌肉切面红染，可见肌细胞内明显的肌纤维，肌膜较为完整和清晰，肌纤维上的条纹明暗规则整齐可见明带和暗带和 Z线。模型组萎缩的肌纤维缩小，颜色较浅,肌纤维边缘变直或下陷，成明显角状，肌纤维间的间隙增宽。此外，肌膜核的数量、形态和位置亦表现异常。横切面上,肌纤维周围的肌膜核增多，纵切面上，肌膜核密集或呈链状排列，可见核移位。横切面上可见肌膜核位于肌纤维的中央部,称为核内移。肌肉细胞浅染，普遍性的萎缩，纤维变性和水肿肌间疏松，明带和暗带和 Z线疏松、模糊消失，肌纤维横截面积缩小，单一视野中细胞肌细胞和数量增加。阳性药物组和给药组中，肌膜的完整性，清晰度，纤维提条纹纹理整齐度均表现出不同程度的恢复，肌肉染色程度增强，明带和暗带和 Z线结构清晰度增强，改善肌肉功能代谢，增加肌细胞形态功能的恢复。肌膜恢复最完整，清晰，肌细胞较整齐，纤维变性，水肿皆得到缓解。
6.乙酰胆碱酯酶抑制活性研究结果：健脾益气补髓方药提取物及药材及有效成分对乙酰胆碱酯酶有很好的抑制作用。
7.健脾益气补髓方药内在质量评估研究：HPLC指纹图谱相似度好， LC-MS技术共鉴定出24个指纹峰中的13个化合物，含量测定方法准确可靠。聚类分析及主成分分析结果表明橙皮苷、毛蕊花糖苷和党参炔苷是本方药的重要化学标志物。
结论：本实验研究结果表明，本方药通过调节线粒体融合与分裂的五种相关蛋白的表达，使线粒体融合分裂重回动态平衡，维持线粒体的形态结构及生物合成稳定，以保障线粒体的稳定发挥，使线粒体恢复其细胞能量工厂的功能，保证细胞正常生命运动。本研究通过对线粒体融合分裂影响能量代谢的研究，除免疫学之外，从另一个角度阐释健脾益气补髓方治疗重症肌无力的多层次，多靶点的作用机制。
病理组织学结果表明：阳性药物组和给药组中，通过脾脏中免疫细胞及增加储血及造血功能；增加胸腺中细胞成分（T细胞前身）的作用较好；这说明本方药的免疫调节功能取得实质性病理改善；改善肌肉功能代谢，增加肌细胞形态功能的恢复。从而起到治疗重症肌无力的疗效。
MG是一种自身免疫性疾病，主要是由自身循环抗体阻塞乙酰胆碱感受器在突触后神经肌的结合位点造成，乙酰胆碱酶抑制剂是一种症状治疗方法，它减慢乙酰胆碱的水解，使得更多的乙酰胆碱激活正常的乙酰胆碱受体，使患者的症状得到短期缓解和改善。至今，乙酰胆碱酶抑制剂是一线和第一步治疗 MG的方法，例如吡斯的明已被安全用于临床60多年，但毒副作用较大，天然产物抗乙酰胆碱酯酶作用安全性高。基于此，本项目开展了健脾益气补髓方提取物、健脾益气补髓方中药味及健脾益气补髓方中单体化合物在对症治疗方面的体外药效活性，结果表明本方药具有很好的抑制乙酰胆碱酶活性，这也是本方药治疗MG的多靶点作用机制之一。
方法：1、用注射免疫抗原的主动免疫方式建立实验性自身免疫性重症肌无力大鼠模型（EAMG），通过观察临床症状、体重变化及检测模型大鼠外周血乙酰胆碱受体抗体（ AchR-ab）水平，评价健脾益气补髓方对实验性自身免疫性重症肌无力动物模型的影响。
2、取健脾益气补髓方高、中、低剂量组，阳性药组（强的松组），模型组等各组大鼠腓肠肌组织标本，通过标本固定、脱水、石蜡包埋和制片、脱蜡和水化、抗原修复、标本固定、血清封闭、一抗和二抗孵育、DAB显色、复染、封片，按照免疫组织化学实验方法流程操作，NIS-ELEMNT BR图像分析系统加载生成的图像，采用显微镜观察及图像分析系统测量蛋白表达的平均光密度值，统计分析实验各组别腓肠肌组织中 Mfn1，Mfn2，Opa1，Drp1，Fis1五个线粒体融合与分裂作用相关调控蛋白表达的差异。
3、取上述实验各组大鼠脾脏、胸腺及腓肠肌，HE染色，图像分析系统检视分析组织学病理形态学，并对腓肠肌中肌纤维横截面积进行测定。
4、采用 Ellman法对健脾益气补髓方药及其中药味对乙酰胆碱酯酶抑制活性进行测试研究，同时进行有效成分与药效活性进行相关项研究。
5、采用液质联用技术、HPLC-ELSD指纹图谱分析和多组分定量分析对本方药物质基础进行多方位质量评价研究。
结果：1.模型建立：首次免疫后45天进行第2次加强免疫， EAMG模型大鼠症状进一步加重，出现呼吸急促，颤抖进一步剧烈，无法抬颈，头部紧贴台面，触及上颌，与正常对照组相比体重进一步减轻， EAMG组大鼠外周血清中AchR-ab分泌水平明显升高，二者具有显著性差异（p＜0.0001）。
2.EAMG体重及症状：与 EAMG组大鼠比较，中药高、中、低剂量组大鼠，从给药20天开始，各剂量组大鼠体重增加较 EAMG组具有统计学差异（ p＜0.01），表明健脾益气补髓方改善 EAMG体重及临床症状。
3.EAMG外周血清中 AchR-ab抗体水平：EAMG组在整个灌胃期间直至结束，大鼠外周血清抗体水平始终高于对照组。与 EAMG相比较，中药各剂量组大鼠外周血清 AchR-ab水平明显降低，中药高剂量组与强的松组相比， EAMG外周血清 AchR-ab水平降低程度相当，未见明显差异（p=0.22＞0.05）。
4.调节线粒体融合与分裂的蛋白的表达水平实验结果：使线粒体处于稳态的五个蛋白 Mfn1，Mfn2，Opa1，Drp1，Fis1免疫组化的表达水平研究结果表明，标记阳性蛋白呈棕黄色或浅黄色，阴性未见黄色蛋白显示。其中对照组相关蛋白表达量较高，阳性程度较高，分布面积较大，造模后动物肌肉中线粒体动力学相关蛋白表达显著下降，模型组中五种相关蛋白表达量减少，比较对照组，表达强度降低（P＜0.01）；给予健脾益气补髓方药后，线粒体中五种蛋白表达上调，使线粒体融合分裂重回动态平衡，维持线粒体的形态结构及生物合成的稳定，保障线粒体的稳定发挥，促进线粒体功能机制的恢复。
5.健脾益气补髓方对免疫器官病理组织学形态学影响结果：脾脏正常组，脾脏内含大量淋巴组织，脾脏实质分红髓、白髓及边缘区三部分；白髓主要由淋巴细胞密集的淋巴组织构成，其又可分为动脉周围淋巴鞘和淋巴小结两部分。动脉周围淋巴鞘由大量 T细胞和少量巨噬细胞与交错突细胞等构成。淋巴小结由大量 B细胞构成；空白对照组脾脏结构未见异常，未见明显的生发中心。模型组脾脏呈萎缩状，其内淋巴细胞含量明显减少，白髓内动脉周围淋巴鞘和淋巴小结残存或几乎消失，红髓内细胞成分显著减少，可见大量含铁血黄素分布，脾脏储血及造血功能严重破坏。健脾益气补髓方与阳性药给药组中，脾脏中白髓内动脉周围淋巴鞘和淋巴小结面积可见不同程度增加，高中剂量组中白髓成分增加较多，阳性药物与低剂量组中白髓成分呈增加趋势，整体红髓功能改善，增加储血及造血功能。
胸腺属于中枢淋巴器官，是淋巴细胞早期分化的场所。淋巴干细胞在其内分裂、分化，能过连续不断地向周围淋巴器官及淋巴组织输送处女型淋巴细胞。胸腺表面的被膜薄层结缔组织伸入胸腺实质形成小叶间隔，分隔胸腺形成胸腺小叶，每个小叶分为皮质和髓质两部分，皮质内胸腺细胞密集，染色较深，髓质中含较多的上皮细胞，染色较浅。正常对照组：胸腺组织内皮质和髓质染色清晰，皮质内富含胸腺细胞，是 T细胞的前身；髓质内含较多胸腺上皮细胞，偶见胸腺小体。模型组胸腺呈萎缩状，细胞成分明显减少，髓质内淋巴细胞分化障碍，凋亡细胞成分增多，可成星空状。皮质成分减少，明显变薄。提供胸腺功能障碍。阳性药物组和给药组中，胸腺中髓质中细胞凋亡形成的星空现象明显减少，增加皮质和髓质细胞成分，增加胸腺功能，其中高中剂量增加胸腺中细胞成分的作用较好，阳性药物组与低剂量组效果相接近。
腓肠肌肌肉组织：正常组肌肉切面红染，可见肌细胞内明显的肌纤维，肌膜较为完整和清晰，肌纤维上的条纹明暗规则整齐可见明带和暗带和 Z线。模型组萎缩的肌纤维缩小，颜色较浅,肌纤维边缘变直或下陷，成明显角状，肌纤维间的间隙增宽。此外，肌膜核的数量、形态和位置亦表现异常。横切面上,肌纤维周围的肌膜核增多，纵切面上，肌膜核密集或呈链状排列，可见核移位。横切面上可见肌膜核位于肌纤维的中央部,称为核内移。肌肉细胞浅染，普遍性的萎缩，纤维变性和水肿肌间疏松，明带和暗带和 Z线疏松、模糊消失，肌纤维横截面积缩小，单一视野中细胞肌细胞和数量增加。阳性药物组和给药组中，肌膜的完整性，清晰度，纤维提条纹纹理整齐度均表现出不同程度的恢复，肌肉染色程度增强，明带和暗带和 Z线结构清晰度增强，改善肌肉功能代谢，增加肌细胞形态功能的恢复。肌膜恢复最完整，清晰，肌细胞较整齐，纤维变性，水肿皆得到缓解。
6.乙酰胆碱酯酶抑制活性研究结果：健脾益气补髓方药提取物及药材及有效成分对乙酰胆碱酯酶有很好的抑制作用。
7.健脾益气补髓方药内在质量评估研究：HPLC指纹图谱相似度好， LC-MS技术共鉴定出24个指纹峰中的13个化合物，含量测定方法准确可靠。聚类分析及主成分分析结果表明橙皮苷、毛蕊花糖苷和党参炔苷是本方药的重要化学标志物。
结论：本实验研究结果表明，本方药通过调节线粒体融合与分裂的五种相关蛋白的表达，使线粒体融合分裂重回动态平衡，维持线粒体的形态结构及生物合成稳定，以保障线粒体的稳定发挥，使线粒体恢复其细胞能量工厂的功能，保证细胞正常生命运动。本研究通过对线粒体融合分裂影响能量代谢的研究，除免疫学之外，从另一个角度阐释健脾益气补髓方治疗重症肌无力的多层次，多靶点的作用机制。
病理组织学结果表明：阳性药物组和给药组中，通过脾脏中免疫细胞及增加储血及造血功能；增加胸腺中细胞成分（T细胞前身）的作用较好；这说明本方药的免疫调节功能取得实质性病理改善；改善肌肉功能代谢，增加肌细胞形态功能的恢复。从而起到治疗重症肌无力的疗效。
MG是一种自身免疫性疾病，主要是由自身循环抗体阻塞乙酰胆碱感受器在突触后神经肌的结合位点造成，乙酰胆碱酶抑制剂是一种症状治疗方法，它减慢乙酰胆碱的水解，使得更多的乙酰胆碱激活正常的乙酰胆碱受体，使患者的症状得到短期缓解和改善。至今，乙酰胆碱酶抑制剂是一线和第一步治疗 MG的方法，例如吡斯的明已被安全用于临床60多年，但毒副作用较大，天然产物抗乙酰胆碱酯酶作用安全性高。基于此，本项目开展了健脾益气补髓方提取物、健脾益气补髓方中药味及健脾益气补髓方中单体化合物在对症治疗方面的体外药效活性，结果表明本方药具有很好的抑制乙酰胆碱酶活性，这也是本方药治疗MG的多靶点作用机制之一。