胆管细胞性肝癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是继肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)后第二种常见的原发性肝癌(primary liver cancer,PLC),又称肝内胆管癌。ICC占原发性肝癌发病率的10~15%,研究表明,近数十年来其发病率和死亡率在中国乃至世界范围内迅速增长,是威胁人类生命健康的主要恶性肿瘤之一。ICC发病隐匿,缺乏特异性临床症状和体征,也没有特异性好、灵敏度高的实验室标记物可以用于早期诊断,病情进展快,大部分患者在首次就诊时已经处于疾病进展期,从而丧失了接受手术治疗的最佳时机,预后极差;而极少数患者,在首次就诊时尚处于早期,积极接受规范化治疗,从而可以获得相对较好的预后。因此,探索ICC有效的早期诊断及治疗方式对改善ICC患者生存预后不可或缺。时至今日,用于诊断ICC的肿瘤分子标记物已经达到十余种,但是这些标记物都存在灵敏度低或是特异度不足等问题,不能有效地用于早期诊断。改善ICC患者预后的关键在于早期诊断,而早期诊断ICC的关键在于高效的特异的筛查诊断手段,寻找准确性高、灵敏度好、特异度高的标记物在临床研究中显得尤为重要。Micro RNAs(mi RN As)是近年来人们发现的一类小的非编码RNA分子,通过与靶基因m RNA 3’末端非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)的碱基配对结合而抑制靶基因的翻译表达。mi RNA广泛参与人体的生长、发育等各个阶段,它的异常表达与多种良恶性疾病的发生发展进程密不可分。在生物体内mi RNA既可以扮演癌基因角色,促进肿瘤发生发展等;也可以扮演抑癌基因角色,抑制肿瘤的侵袭转移等。不同种类的肿瘤中mi RNA的表达水平具有显著的差异性,并且能够稳定地被检测,因此在未来的生命科学研究中将mi RNA作为新型标志物是很有希望的。本课题采用mi RNA芯片检测、RT-q PCR分析、ROC曲线评价等研究方法,期望找到可以用于ICC诊断的特异性mi RNA。本课题主要包含以下四个研究部分:第一部分:收集整理病历及标本资料,选择入组患者方法:运用数据录入管理软件Epidata 3.1完善肝癌患者病历资料数据库,依据纳入标准收集入组的胆管细胞性肝癌患者及对照者的临床指标;运用统计学分析软件SPSS 21.0检测两组患者临床指标的均衡性。结果:胆管细胞性肝癌组患者血清ALB值为40.9 g/L±4.30 g/L,明显低于对照组平均血清ALB值44.9 g/L±3.84 g/L,其组间差异存在统计学意义(P=0.010);而转氨酶、胆红素等其它临床指标间的差异均没有统计学意义。结论:白蛋白在肝脏合成,是评定机体营养状态的重要指标。慢性消耗性疾病如恶性肿瘤,白蛋白会有所降低。实验组和对照者组间的临床指标相似,一致性较好,具有可比性。第二部分:建立胆管细胞性肝癌mi RNA表达谱,选择目标基因mi RNA-150方法:采用mi RNA芯片检测技术,建立胆管细胞性肝癌的mi RNA表达谱,经过数据分析与文献研究后选择进一步研究的目标基因。结果:mi RNA芯片检测显示,胆管细胞性肝癌患者癌组织中表达水平明显下调的mi RNA有:mi R-150、mi R-638、mi R-4459、mi R-4530及mi R-378c,而表达量明显增高的mi RNA有:mi RNA-660、mi R-425、mi R-93、mi R-494以及mi RNA-574。经研究文献并讨论后,最终选择mi RNA-150为后续研究的目标基因。结论:本部分实验通过mi RNA芯片所获得的胆管细胞性肝癌的mi RNA表达谱与既往研究发现的表达谱不完全一致。个体样本间的异质性可能是出现这种现象的主要原因。同时也说明了胆管细胞性肝癌的发生发展具有复杂性和多样性,涉及多个基因参与并调控。mi RNA-150在胆管细胞性肝癌中的作用尚无相关研究报道,选择mi RNA-150作为进一步研究的目标基因符合该课题的研究目的,具备可行性。第三部分:运用RT-q PCR检测组织与血浆标本mi RNA-150表达水平方法:对于癌组织及癌旁组织标本采用mi RNeasy®Mini试剂盒提取总RNA;对于血浆标本采用RN24-BLOODmisi试剂盒提取总RNA。采用分光光度计检测得到的总RNA溶液的纯度与浓度,运用RT-q PCR技术检测标本中mi RNA-150的表达水平。结果:与癌旁组织标本相比,mi RNA-150在胆管细胞性肝癌癌组织标本中表达水平显著降低;与对照者的血浆标本相比,mi RNA-150在ICC患者血浆中表达明显上调。结论:mi RNA-150在ICC患者癌组织中下调表达,然而在其血浆中上调表达。也有研究报道mi RNA-150在其他肿瘤组织中上调或是下调表达,因此我们认为它在不同肿瘤中具有不同的表达谱,其异常表达是恶性肿瘤中的普遍现象。对于其在组织及血液中相反的表达结果,分析认为mi RNA-150在ICC中可能扮演着抑癌基因角色,通过负反馈调节的作用使得血液中mi RNA-150表达水平增高。第四部分:胆管细胞性肝癌患者血浆mi RNA-150的临床意义分析方法:以15例胆管细胞性肝癌患者血浆mi RNA-150的表达水平及其各项临床指标为基础,使用统计学软件SPSS 21.0分析mi RNA-150的临床意义,当P值小于0.05时认为差异具有统计学意义。结果:血浆mi RNA-150可以用来作为诊断胆管细胞性肝癌的分子标志物,当mi RN A-150与血清CA19-9联合应用时,诊断的灵敏度及特异度分别可以达到80%和100%、而AUC可以达到0.920。根据15例ICC患者血浆m RNA-150的平均表达量,将血浆中mi RNA-150表达量小于等于-0.507的8名ICC患者归为低表达组,将mi RN A-150表达量大于-0.507的7名患者归为高表达组。统计分析显示:胆管细胞性肝癌患者血浆mi RNA-150表达水平与其肿瘤大小、CA19-9、肿瘤分期以及GGT等各项临床指标无相关性。结论:mi RNA-150单独诊断ICC具有较高的灵敏度,达到93.3%,但特异度相对较低,AUC为0.791。因此,我们将mi RNA-150与CA19-9联合应用于诊断胆管细胞性肝癌,其灵敏度、特异度以及准确性得到不同程度改善。与此同时,研究还发现ICC患者血浆mi RNA-150表达水平与肿瘤大小、CA19-9、肿瘤分期、GGT等指标无相关性。这也说明mi RNA-150在胆管细胞性肝癌中表达稳定,有望成为特异性ICC标记物。