论文部分内容阅读
酶作为一种高效的生物催化剂,具有高效性、强专一性等特点,许多难以进行的有机反应在酶的催化下都能顺利完成。然而,对于非专一性底物,酶催化往往无法实现其高效转化。因此,如何调控酶结构强化其对非专一底物的催化转化是近些年来生物化学以及催化化学等领域的研究热点。本论文利用介孔二氧化硅材料构筑固定化酶催化剂,利用限域空间内固定化酶的界面活性效应强化其对非专一性底物的催化活性。通过调控介孔二氧化硅的几何微环境(孔道形状、孔道尺寸)以及化学微环境(表面亲疏水性),深入研究限域空间内固定化酶的界面活化效应。主要研究工作如下:1、利用具有二维六方孔道结构的介孔SBA-15以及三维笼状孔道结构的介孔MCF作为载体,控制孔道尺寸相近的条件下(～11 nm),构筑固定化黑曲霉脂肪酶催化剂SBA-15-ANL与MCF-11-ANL,关联限域空间的孔道形状与反应活性。在催化非专一性底物对氟苯亚甲基丙二腈合成4-H吡喃类药物的反应中,固定化酶SBA-15-ANL(174.6 U g-1)与MCF-11-ANL(246.9 Ug-1)均得到了高于游离酶(64.2 Ug-1)的活性。利用荧光光谱和衰减全反射(ATR)-FTIR研究三级结构和二级结构,结果表明不同孔道形状载体对酶界面活化作用,界面活化作用依赖于限域效应,三维笼状MCF-11可以为酶提供更强的界面活化效应;2、利用具有三维笼状孔道结构的介孔SBA-16和MCF作为载体,构筑固定化黑曲霉脂肪酶催化剂,调控限域空间的孔道尺寸(8、11、23、31 nm),关联限域空间的孔道尺寸与反应活性,深入研究限域空间内固定化酶的界面活化效应。在催化非专一性底物对氟苯亚甲基丙二腈合成4-H吡喃类药物的反应中,反应活性随着孔径增加存在最优值,当孔道尺寸为11nm时,MCF-11-ANL催化活性高达246.9Ug-1。荧光光谱研究表明活性依赖于三维结构Trp微环境的极性,ATR-FTIR研究表明α-螺旋含量的增加量和β-转角含量的减少量依赖于孔道尺寸,并给出了可能的活性位点氨基酸相对位置的变化情况以及对底物在活性中心的结合方式;3、利用具有三维笼状介孔二氧化硅MCF表面羟基的可修饰性,分别对其表面进行后接枝修饰不同链长的疏水烷基,构筑了不同疏水性质的化学微环境,用于催化非专一性底物对氟苯亚甲基丙二腈合成4-H吡喃类药物的反应中,与未改性载体MCF-23(173.3 Ug-1)的活性相比,甲基改性的微环境MCF-23-CH3-ANL的活性最优(233.7 U g-1),但随着疏水链的增长,活性会有一定程度的降低(121.9、92.2、54.8、33.5 Ug-1),表明随着疏水性进一步增太强活性降低;利用荧光光谱和ATR-FTIR研究三级结构和二级结构,结果表明界面活化作用随着载体表面疏水性增加增强,疏水改性更有利于酶二级结构的保持;4、进一步研究组装催化剂MCF-23-ANL的重复使用性能,重复使用性研究表明使用5次后MCF-23-ANL仍然能保持72%的初始活性;底物普适性研究表明,MCF-23-ANL还可催化对硝基苯亚甲基丙二腈、对氯苯亚甲基丙二腈、苯亚甲基丙二腈、对羟基苯亚甲基丙二腈底物的反应,对带有吸电子取代基的底物具有更好的反应活性。