论文部分内容阅读
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是一种分布特别广泛的条件性致病菌,在烧伤病人、免疫力低下病人体内,它几乎可以感染人体的任何组织甚至危及患者生命。Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system, T3SS)分泌的毒性因子可以引起铜绿假单胞菌的急性感染,同时具有逃避宿主细胞免疫的作用。研究铜绿假单胞菌中的T3SS的表达调控机制将为探寻以T3SS为主要靶点的治疗方法提供理论基础。本文以本实验室构建的筛选铜绿假单胞菌中T3SS中毒性因子基因exoS表达发生变化的两株转座突变体为研究对象,详细研究了影响T3SS表达的两个潜在调节基因：PA3284和PA1775。通过基因敲除和基因过表达的方法研究了这两个基因对T3SS基因的调控作用及机理,实验将T3SS相关基因exoS、 exoY、exoT、exsC、exsD的启动子与报道子luxCDABE相融合,并将融合体整合到突变体和野生型菌株中,通过比较启动子活性的变化(即发光量变化),检测了PA3284和PA1775对这些基因的调节作用。同时,通过在含有exoS、exoY、 exoT、exsC、exsD启动子-luxCDABE融合体的菌株中过表达潜在调节基因,进一步验证了其调控作用。结果表明,虽然在PA3284基因中插入强烈影响了exoS基因的表达,但在PA3284敲除突变体中exoS基因的表达与在野生型中没有明显的不同,说明基因PA3284本身对exoS基因没有调节作用。由于转座子存在强启动子,它的插入可以过量表达下游基因,实验检验了过表达PA3281-3284操纵子对T3SS相关基因的影响,结果证明这一操纵子的过量表达可以导致exoS基因表达的升高,说明是T3SS的调节基因。进一步研究表明操纵子PA3281-3284对T3SS的调控并不是通过已知的调控途径来是实现的。针对T3SS调节基因PA1611的研究发现,转座子插入PA1775基因可以影响PA1611的表达,进而影响T3SS相关基因、运动性和生物膜的生成。实验发现,不同的转座子插入位置对PA1611表达影响的程度不同。但在PA1775的敲除突变体中exoS的表达与野生型没有明显差别。暗示完全将基因PA1775缺失并不影响T3SS的活性,PA1775的完整性和表达变化似乎影响PA1611以及T3SS相关基因的表达。进一步的互补实验证明,携带在质粒上的完整的PA1775可以使所有PA1775转座突变体恢复到野生型的表型状态。总之,这一研究揭示了铜绿假单胞菌中T3SS新的调节因子,为进一步探索T3SS的调控途径以及铜绿假单胞菌的致病性提供了新的线索。