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昆虫细胞色素P450单加氧酶(Cytochrome P450 monooxygeneases,CYPs)是一个基因超家族(Gene Superfamily)编码的酶系,在杀虫剂等外源化合物解毒以及内源激素等代谢中承担着重要功能。研究表明,一些保守的、参与内源代谢的细胞色素P450对昆虫生长发育是必需的。随着昆虫基因组测序的完成,越来越多的CYPs基因被鉴定。飞蝗Locusta migratoria作为世界性的重要农业害虫,已发现至少有78个细胞色素P450基因,但研究主要集中在外源代谢解毒机制方面,而对其内源代谢机制的研究极少。本文发现飞蝗Lm CYP4G和Lm CYP303A1基因在参与内源代谢方面具有重要的生理功能,并对mi RNA调控飞蝗Lm CYP303A1的表达进行了探索,主要研究内容如下:一、Lm CYP4G62和Lm CYP4G102在飞蝗表皮碳氢化合物合成中的作用利用RT-q PCR和Western blot分析了飞蝗2个Lm CYP4G基因在不同发育天数和组织部位的表达情况,结果表明,Lm CYP4G62主要在发育中期表达较高,而Lm CYP4G102在所有发育阶段均表达较高;但二者均在体壁和脂肪体中高表达。免疫荧光染色结果显示,Lm CYP4G62和Lm CYP4G102均在绛色细胞中表达,但二者的亚细胞定位不同,Lm CYP4G62定位于细胞质膜上,而Lm CYP4G102定位于细胞质中;采用RNAi技术分别沉默Lm CYP4G62和Lm CYP4G102后,导致表皮碳氢化合物(Cuticle Hydrocarbons,CHCs)含量下降,其中沉默Lm CYP4G102后,所有种类的CHCs含量均下降,而沉默Lm CYP4G62只有相对较短链的CHCs含量降低;进一步,采用RNAi结合杀虫剂生物学测定实验和干燥实验进行检测分析,结果发现,抑制2个Lm CYP4G基因的表达,可导致杀虫剂通过表皮的渗透性升高,飞蝗对干燥胁迫和杀虫剂的敏感性增强。研究结果表明,Lm CYP4G62和Lm CYP4G102均参与飞蝗碳氢化合物的合成,且对飞蝗保水和杀虫剂渗透性具有重要作用。二、Lm CYP303A1的分子特性及在飞蝗发育过程中的功能研究利用RT-q PCR技术,分析Lm CYP303A1基因在飞蝗不同发育天数和组织器官的表达情况,结果表明,Lm CYP303A1主要在若虫蜕皮前表达较高,成虫期表达很低,且在表皮、翅、前肠和后肠中高表达;沉默Lm CYP303A1的表达,可导致飞蝗若虫到若虫或若虫到成虫发育期蜕皮致死;此外,沉默Lm CYP303A1的表达,可有效抑制CHCs合成关键基因的表达,导致部分CHCs含量降低,进一步增强了对干燥和杀虫剂的敏感性;此外,沉默Lm CYP303A1的表达,可抑制飞蝗旧表皮降解和新表皮合成,影响表皮蛋白和几丁质酶基因的表达。三、果蝇Cyp303a1的生物学功能研究CYP303A1在昆虫中具有很高的保守性,为了进一步研究CYP303A1在不同物种中的保守功能,本文对果蝇Cyp303a1的生理功能进行了相关研究。利用RT-q PCR技术分析Cyp303a1在不同发育阶段及不同组织部位的表达,研究发现,其主要在白色预蛹期的环腺和蛹期第2天的翅中表达较高;利用GAL4/UAS系统在不同组织部位沉默Cyp303a1的表达,发现全身或表皮沉默Cyp303a1后,可导致果蝇羽化致死或羽化后翅无法展开而死亡,翅特异性沉默Cyp303a1后,也会导致果蝇成虫翅无法展开;使用Gal80ts在不同时期抑制Cyp303a1的表达,结果表明,Cyp303a1在果蝇蛹中期阶段发挥重要作用。果蝇Cyp303a1的突变体在胚胎后期有80%的致死率,全身过表达果蝇Cyp303a1可以挽救果蝇Cyp303a1突变体表型,全身过表达飞蝗Lm CYP303A1则不能挽救。这一结果表明,果蝇Cyp303a1在其胚胎发育过程中至关重要,且果蝇与飞蝗CYP303A1在胚胎发育过程中具有一定的功能差异性。四、mi RNA对飞蝗Lm CYP303A1基因的调控机制研究为深入探究飞蝗Lm CYP303A1的转录调控机制,本文通过生物信息学方法,预测发现mi R-184与飞蝗Lm CYP303A1具有结合位点;通过RT-q PCR检测分析表明,mi R-184与Lm CYP303A1的发育表达变化呈负相关;进一步,通过双荧光素酶实验以及RIP实验分析表明,mi R-184与Lm CYP303A1存在直接的相互作用;同时,体内注射mi R-184的激动剂或抑制剂,沉默或过表达mi R-184后,均会导致飞蝗因蜕皮困难致死,与沉默飞蝗Lm CYP303A1的结果相一致。这些研究结果表明,飞蝗mi R-184通过调控Lm CYP303A1的表达,在其蜕皮过程中发挥着重要功能。综上所述,本文系统研究了参与飞蝗内源代谢的3个细胞色素P450的生理功能以及mi RNA对飞蝗Lm CYP303A1的调控机制。研究结果不仅可为渐变态昆虫的相关研究提供新资料,而且有助于害虫防治新靶标的研发。