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前言宫颈癌(cervical cancer,CC)是妇女最常见的恶性肿瘤之一,现已确认高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)是宫颈癌形成最重要的危险因子,99.7%的浸润性宫颈癌中可以检测到HR-HPV的存在。因此,通过高危HPV的检测来筛查易患人群,追踪HPV感染状态,随访HPV是否被清除,是预防宫颈癌发生的关键。但并非所有感染HPV的患者都会发展为宫颈癌,仅检测到患者感染了HPV而不进一步检查就无法了解宫颈病变的程度和发展趋势。Pin1是从细胞周期水平来调控Pin1是一种独特的肽基脯氨酰顺反异构酶,它专一性催化已磷酸化的丝/苏-脯氨酰发生顺反异构,导致功能改变。这种构型转变是新发现的蛋白磷酸化后调节机制,主要关系到细胞增殖和转化。在宫颈上皮内病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈癌中呈高表达,在正常对照组不表达,因此如果通过对宫颈癌病因学因素HPV和生物标志物因素Pin1,CyclinD1的联合检测,来对宫颈癌高危人群进行筛查,可能具有重要意义。本研究对93例宫颈液基细胞残液及相应的组织学标本应用原位杂交法检测HPV16/18,并用免疫组化法检测Pin1,CyclinD1,以探讨二者在子宫颈癌发生发展中的生物学意义及临床应用价值,试图为提高宫颈癌易患人群检出率,进而为宫颈癌的预警和早期诊断提供更科学有效的方法,达到早诊早治,降低宫颈癌发病率死亡率的目的;并为开发简便易得的分子筛查技术资源提供理论基础。材料和方法一、材料(一)研究对象570例宫颈液基细胞学残液标本,均经LCT(Liquid-based Cytology Test,LCT系统)诊为宫颈上皮内病变及宫颈癌,来自2006年9月～2007年10月中国医科大学附属第一医院妇科。无宫颈手术史、未孕、无盆腔放射治疗史,年龄26～72岁,平均年龄48.4岁。40例子宫颈癌、40例CIN患者及13例对照组其中子宫颈浸润癌40例、CINⅡ-Ⅲ19例、CINⅠ21例。(二)主要试剂、仪器和来源鼠抗人HPV16/18 E6抗体和羊抗鼠IgG-HRP抗体,鼠抗人Pin1,CyclinD1抗体均购自美国Santa Cruz公司。HPV原位杂交试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。免疫组化S-P试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。二、方法(一)免疫组织化学染色用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)检测Pin1,CyclinD1的表达。结果判定:Pin1蛋白定位于胞核,胞核内见棕黄色颗粒为阳性。由3名有经验的病理医师在双盲法下独立计数。细胞涂片主要计数有病变的细胞,异常宫颈上皮细胞着色大于10%则判定为阳性标本。细胞片和组织片在光镜下根据着色范围分为:阳性细胞数小于10～24%为(+);阳性细胞数25～49%为(++);阳性细胞数50～74%为(+++);阳性细胞数大于75%为(++++)。Cyclin D1以肿瘤细胞核出现淡黄或棕黄色颗粒为阳性细胞,每片随机观察5个视野,取其均值,阳性细胞率＞10%为阳性。(二)原位杂交检测HPV16/18 DNA的表达。细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性。阳性细胞数小于25%为(+);阳性细胞数25%～49%为(++);阳性细胞数50%～74%为(+++);阳性细胞数75%～100%为(++++)。(三)westernHPV蛋白提取:将盛有样本的试管置于碎冰上,用超声破碎机破碎细胞,4℃12 000/g离心,45 min。取上清液,定量、备用。电泳、显色:采用十二烷基硫酸钠变性聚丙烯酰胺凝胶不连续缓冲系统,先后配制15%的分离胶和5%浓缩胶;取蛋白样品,上样20μl(约含蛋白60μg),电泳后将醋酸纤维素膜铺到胶上进行转印,42v,2h.加入一抗(1:200)过夜,加入二抗(1:2000)37℃,DAB显色3～5min。该膜上有显色带出现为阳性;若无显色,为阴性表现。(四)统计学分析对所得结果各组间采用x~2检验及Fisher’s确切概率法检验,P＜0.05有统计学意义;用Spearman等级相关分析检验HPV16/18感染与Pin1表达的关系,P＜0.05有统计学意义。结果一、免疫组化法检测Pin1,CyclinD1的表达Pin1在细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性,CyclinD1在细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性,过表达时胞核胞浆均着色,周围正常结缔组织、血管、间质细胞显示弱的着色。Pin1在正常宫颈脱落细胞及宫颈组织中不表达或弱表达,在各组宫颈病变中有不同程度的表达:Pin1在正常,CINⅠ,CINⅡ-Ⅲ,浸润癌中的表达率分别为7.7%(1/13),57.1%(12/21),68.4%(13/19),85%(34/40),CyclinD1在正常,CINⅠ,CINⅡ-Ⅲ,浸润癌中的表达率分别为0%,9.52%(2/21),21.1%(4/19),55%(22/40)。随着宫颈上皮病变程度的加重呈现增高的趋势二、原位杂交法检测HPV16/18 DNA的表达HPV16/18 DNA在细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性,部分病例可在胞浆中见到棕黄色颗粒。HPV16/18 DNA在正常宫颈脱落细胞及宫颈组织中不表达或弱表达,在各组宫颈病变中有不同程度的表达:在正常、CINⅠ、Ⅱ/Ⅲ和宫颈癌中,HPV16/18 DNA的阳性率分别为15.4%(2/13)、42.9%(9/21)、57.9%(11/19)和82.5%(33/40),随着宫颈上皮病变程度的加重呈现增高的趋势。三、Western法检测HPV16/18的表达HPV16/18在正常、CINⅠ、Ⅱ/Ⅲ和宫颈癌中,阳性率分别为23.1%(3/13),57.1%(12/21),68.4%(13/19),85%(34/40)。随着宫颈上皮病变程度的加重呈现增高的趋势。四、Pin1,cyclinD1与HPV16/18感染在宫颈各级别病变中的相关性Pin1与HPV16/18相关性高(r_s=1.0,P＜0.05),CyclinD1与HPV16/18相关性低(r_s=0.6,P＜0.05)结论1、Pin1,CyclinD1和HPV16/18在宫颈上皮内病变及宫颈癌中,随着病变程度的加重而检出率增高。2、Pin1的表达和HPV16/18的感染在宫颈病变中呈正相关,二者联合检测可提高宫颈病变筛查的准确度。3、Western-blot检测HPV16/18E6具有较高的灵敏性,尤其是在CIN组,适合于对宫颈疑难病例的检测,作为HPV16/18检测的辅助手段。4、无论是Pin1还是HPV16/18,在宫颈液基细胞学残液和相应组织中的检测结果都是基本一致的,作为宫颈病变检测的辅助手段。