牙髓根尖周疾病是一种口腔常见疾病，目前而言根管治疗是其首选治疗方法。原则上来讲，完善的根管治疗可以促进根尖周病变的愈合，但是临床上仍有一部分失败病例，研究发现其主要原因是根管内细菌的持续性存在；而在对根管再感染病例的研究中发现，粪肠球菌又以其高检出率引起关注。粪肠球菌属于链球菌科、肠球菌的一种，是人类口腔、肠道常驻菌；其具有一些特殊能力，如侵入牙本质小管、对氢氧化钙等一般抗菌药物耐受、抗饥饿能力以及单独形成生物膜能力。凭借其特殊能力，它在根管再感染中发挥重要作用，研究发现其在根管再感染中的检出率远大于在原发性感染中，已有大量学者研究其在再治疗根管中的分离率，但是究竟其高检出率是否与患者个体因素、患牙情况、治疗时间长短等因素有关？不同分离株生物特性是否一致？值得我们研究分析。本实验以根管治疗后再感染病人为研究对象，收集样本，分离鉴定，研究其生物学特性，为临床彻底消除粪肠球菌造成的再感染提供依据。另外，目前对和粪肠球菌生物膜形成有关的毒力因子已有很多研究，如ESP、GelE、SprE、frs等，本实验研究中发现一种和生物膜形成相关的新基因bfrg，该基因被突变后，粪肠球菌生物膜的形成量显著降低。为更好研究观察生物膜动态形成过程，构建粪肠球菌绿色荧光蛋白稳定表达载体这一有力工具成为必要。实验分以下四个部分：一、再治疗根管内E.f的采集分离鉴定本实验收集临床病例样本54例应用特异性较高的粪肠球菌选择性培养基与粪肠球菌琼脂分离培养；应用16SrRNA技术从基因水平上对分离株进行鉴定，以再治疗根管为对象，进而研究不同宿主、不同微环境下粪肠球菌的检出率。54例临床病例中有18例分离鉴定出粪肠球菌，检出率为33.3%。经统计分析：再治根管内粪肠球菌的检出率在患者性别、年龄、患牙根尖周阴影大小及距离上次根管治疗时间长短等方面无统计学差异（P＞0.05）；但与上次根管治疗根充是否到位有关，欠填根管中粪肠球菌的检出率明显高于恰填根管中粪肠球菌的检出率，有统计学差异（P<0.05），而不同欠填长度组间粪肠球菌的检出率无统计学差异（P＞0.05）。说明粪肠球菌在根管再感染中还是有较高的检出率；而且临床中欠填比恰填更容易引起粪肠球菌再感染根管，提示为防止根管再感染，临床根管治疗中我们更应当把根管适当的充填重视起来。二、粪肠球菌分离株生物特性的研究本实验以实验一获得的18株粪肠球菌分离株为对象以标准株（ATCC29212）为对照，研究其生物学特性。1.分别通过铺板计数法和测OD值法对比其生长曲线；2.通过96孔板培养CV染色测OD法对比其生物膜形成能力；3.通过2倍稀释比浊法测MIC对比其对几种常用抗生素的耐药性。结果显示：对照株及各临床分离株生长曲线测定15h，0-4h为恢复期，4-12h为对数生长期，12h以后达到平台期（P＞0.05），对照株及分离株各时间点OD₆₀₀值及细菌浓度无统计学差异（P＞0.05）；对照组及各临床分离株对氨苄青霉素、卡那霉素及万古霉素敏感，对四环素和红霉素有一定的耐药性，但各菌株间无统计学差异；标准株及各临床分离株均可形成生物膜，但标准株及临床分离株OD₅₇₀值无统计学差异（P＞0.05），即各菌株生物膜形成量无显著性差异。说明各个分离株与对照株生长特性无显著差异，粪肠球菌对万古霉素较为敏感。三、与生物膜形成相关的bfrg基因的发现本实验用EZ-Tn5DHFR-1Tnptransposome转座子转化E. faecalis菌，构建了E. faecalis菌的突变菌库，用结晶紫（CV）、Syto9、FDA三种不同的染色方法筛选生物膜形成缺陷的突变菌株，进而克隆并获得引起细菌生物膜形成显著降低的突变基因，发现一个功能未知的基因在被突变后，E.faecalis菌的生物膜形成能力显著降低，我们将其命名为生物膜形成相关基因（bfrg基因）。结果显示：与对照的野生型E. faecalis菌相比，bfrg基因突变菌株形成的细菌生物膜无论在总量上还是在其活细胞含量上，都显著降低（超过50%）；粪肠球菌bfrg基因突变后，其形成的15h生物膜与野生型细菌相比，在绿色荧光强度、生物膜总体积、表面积以及最大生物膜厚度等指标均显著降低；而在生物膜孔隙率、粗糙度等方面显著增加。说明bfrg基因突变后，粪肠球菌的生物膜形成量显著降低，厚度减小，内部的空隙变大， bfrg基因可能对生物膜形成有促进作用。四、粪肠球菌荧光基因稳定表达载体的构建本实验以pFW5这一细菌常用自杀载体为骨架，选取粪肠球菌上保守基因乳酸脱氢酶为靶点，分别设计两对引物PCR扩增目的片段pus、pds连入pFW5；为了利用载体pUC18上的核糖体结合位点，将从载体pAcGFP1-1中扩增出绿色荧光蛋白基因片段gfp连入载体pUC18中，再设计引物从其中扩增出带有核糖体结合位点的荧光蛋白基因片段gfp*,继续连入pus、pds中间，构建成能稳定表达的带有核糖体结合位点的粪肠球菌荧光蛋白载体pFW5-pus-pds-gfp*。通过设计验证引物PCR鉴定、酶切鉴定、测序确定载体已构建成功，为进而构建其荧光菌株做好准备。