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研究背景支气管哮喘(简称哮喘,asthma)是由多种细胞和细胞组份介导的气道慢性炎症性疾病,是全球最常见的慢性呼吸道疾病之一,也是终生发病率最高的慢性疾病之一。哮喘严重影响个人健康且带来巨大社会负担,全球学者致力于其发病机制和防治方法的研究。气道重塑是哮喘特征之一,被认为是引起不可逆性呼吸道气流受限和持续的气道高反应性(airway hyperresponsiveness, AHR)的重要原因,是导致哮喘难治的病理基础。目前常用的治疗哮喘的药物在改善气道重塑方面疗效并不确切,对气道重塑发病机制及治疗方法的研究是目前哮喘研究中的热点。1,25-二羟维生素D3 (1,25-dihydroxy vitamin D3,1,25-(OH)2D3)传统上被人们认为是人体不可或缺的营养物质,但近年研究发现作为一种甾体激素,其作用远远不止于此。哮喘方面,目前研究发现1,25-(OH)2D3可能通过基因、抗感染、影响肺发育、增强糖皮质激素反应性等机制同哮喘发生、哮喘控制、哮喘患者糖皮质激素敏感性有关,有研究显示1,25-(OH)2D3还可能减轻气道重塑。气道上皮损伤在哮喘发病机制中的作用越来越受到重视,一系列研究表明哮喘的发病及临床表现都同气道上皮物理屏障及生物屏障功能改变之间存在联系。气道上皮细胞(airway epithelial cells, AECs)凋亡是上皮损伤的其中一种表现,生理条件下AECs的凋亡是维持机体稳态所需,但病理条件下AECs的过度凋亡是有害的,同气道炎症、气道重塑及AHR均有关。目前研究对哮喘中AECs凋亡程度报道不一致。众多研究显示1,25-(OH)2D3对细胞凋亡的作用呈现双向性,而1,25-(OH)2D3对AECs凋亡的影响目前尚未见报道。本研究通过建立哮喘气道重塑小鼠模型,探讨1,25-(OH)2D3是否能抑制哮喘气道重塑、哮喘中AECs凋亡情况、1,25-(OH)2D3对哮喘AECs凋亡的影响。研究目的观察1,25-(OH)2D3对哮喘小鼠气道重塑及AECs凋亡的影响。研究方法1.清洁级雌性Balb/c小鼠60只,体重17g-19g,随机分为3组：正常对照组(A组)、哮喘组(B组)和1,25-(OH)2D3干预组(C组),每组各20只。以卵蛋白(ovalbumin, OVA)致敏和激发的方法制备小鼠慢性哮喘模型。末次激发后24h内一半小鼠腹腔戊巴比妥注射麻醉,气管切开插管,测定基础肺功能及不同浓度梯度(0.025、0.05、0.1、0.2mg/kg)乙酰甲胆碱(Ach)激发下的肺功能,测量指标包括吸气阻力(inspiratory resistance, Ri)、呼气阻力(expiratory resistance, Re)、动态顺应性(dynamic compliance, Cdyn);另一半小鼠处死后行气道重塑相关指标检测。肺组织HE染色,光镜下找到完整的支气管横断面,应用图象分析软件测定支气管基底膜周径(basement membrane perimete, Pbm)、管壁总面积(total wall area, Wat),并用Pbm将测得的Wat标准化,以Wat/Pbm代表支气管管壁厚度。肺组织石蜡切片分别行阿利辛兰-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色、Masson三联染色、α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)免疫组织化学染色观察气道粘液分泌情况、胶原纤维增生情况及气道平滑肌厚度,结果分别以AB-PAS染色阳性面积/Pbm (AB-PAS(+)area/Pbm)、Masson染色阳性面积/Pbm (Wcol/Pbm)、 α-SMA染色阳性面积/Pbm (α-SMA(+)area/Pbm)来表示。2.小鼠肺组织石蜡切片经末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL法)检测AECs凋亡情况,结果以凋亡指数(apoptosis index, AI)表示；免疫组织化学染色检测气道上皮Bcl-2的表达,结果以平均光密度(optical density, OD)值表示。研究结果1.肺功能：A、B、C组小鼠Ri分别为(1.16±0.06)、(1.49±0.08)、(1.29±0.05)cmH2O/(ml/s); Re分别为(1.02±0.15)、(1.48±0.16))、(1.29±0.07)cmH2O/(ml/s); Cdyn分别为(0.03±0.03)、(0.02±0.04)、(0.02±0.02)ml/cmH20。B、C组Ri及Re均较A组升高,Cdyn均较A组减低,差异均有统计学意义(P值均<0.05)；C组小鼠Ri、Re较B组下降(P<0.05)。Ach激发时B、C组呈现气道高反应性。各浓度梯度Ach激发下,Ri、Re同基础值相较变化的百分数B、C组无明显差异；Ach浓度达到0.2mg/kg时,C组Cdyn下降程度小于B组(P<0.05)。2.肺组织病理(HE染色)：光镜下,A组小鼠支气管黏膜上皮、黏膜肌层、肺组织结构完整整齐,支气管管腔规则,无明显炎症细胞浸润。B组小鼠管腔狭窄,气道壁明显增厚,支气管黏膜增厚,可见黏液栓堵塞及支气管粘膜上皮脱落,气道平滑肌层增厚,支气管周围及粘膜下有大量炎性细胞浸润。C组气管壁增厚及管周炎症方面较B组小鼠有所减轻。A、B、C组小鼠Wat/Pbm分别为(7.79±1.01)、(19.24±1.70)、(14.12±2.13)um2/um。B、C组均明显高于A组(t值分别为11.78、6.51,P值均<0.05),C组低于B组(t值为5.26,P<0.05)。3.粘液分泌(AB-PAS染色)：AB-PAS染色阳性信号为蓝色(酸性粘液)、红色(中性粘液)或混合呈紫红色。镜下A组不见或仅见点状AB-PAS染色阳性信号。B组气管上皮内AB-PAS染色阳性信号面积明显增加。C组较A组也明显增加,但较B组有所减少。A、B、C组小鼠AB-PAS(+)area/Pbm分别为(0.04±0.02)、(5.22±0.90)、(3.71±0.56) um2/um。B、C组均明显高于A组(P值均<0.01),C组低于B组(P<0.05)。4.胶原纤维沉积(Masson染色)：气道上皮下胶原纤维染为绿色。A组胶原纤维为极薄一层环绕气管。B组气道上皮下胶原沉积明显增加,形成一较厚致密层。C组胶原沉积较A组也明显增加,但较B组有所减少。A、B、C组小鼠Wcol/Pbm分别为(1.37±0.25)、(7.63±1.55)、(4.31±0.65)um2/um。B、C组均明显高于A组(t值分别为11.02、5.18,P值均<0.05),C组低于B组(t值为5.83,P<0.05)。5.气道平滑肌厚度(α-SMA免疫组织化学染色)：气道平滑肌层染为棕黄色。A组气管壁α-SMA免疫组织化学染色阳性可见,为极薄一层环绕气管。B、C组α-SMA免疫组织化学染色阳性区域明显增厚,C组较B组减轻。A、B、C组小鼠α-SMA(+)area/Pbm分别为(1.40±±0.24)、(5.40±±0.69)、(3.27±±0.46)um2/um。B、C组均明显高于A组(t值分别为13.89、6.50,P值均<0.05),C组低于B组(t值为7.38,P<0.05)。6.AECs凋亡(TUNEL):细胞核染为棕黄色者为凋亡细胞。A组小鼠AECs中不见或偶见TUNEL(+)的细胞。B、C组小鼠AECs中TUNEL(+)者明显增多,C组TUNEL(+)细胞比率较B组降低。A、B、C组小鼠AECs的AI值分别为(0.0045±±0.0038)、(0.2973±±0.0574)、(0.1489±±0.0175)。B、C组相较有显著差异(P<0.01)。7.Bcl-2免疫组织化学染色：阳性细胞胞浆或胞核呈棕黄色。A组小鼠气道上皮组织表达较多Bcl-2蛋白,B组小鼠Bcl-2表达很少,C组小鼠可见Bcl-2表达,但含量较A组降低。A、B、C组小鼠气道上皮Bcl-2免疫组化OD值分别为(0.1603±±0.0209)、(0.0912±±0.0230)、(0.1139±±0.0086),B、C组均明显低于A组(t值分别为7.44、3.52,P值均<0.05),C组高于B组(t值为3.92,P<0.05)。研究结论1、1,25-(OH)2D3可减轻慢性哮喘小鼠的气道重塑；2、慢性哮喘小鼠气道上皮细胞凋亡率较正常对照明显升高；3、1,25-(OH)2D3可减少慢性哮喘小鼠气道上皮细胞的凋亡；4、1,25-(OH)2D3减少慢性哮喘小鼠气道上皮细胞凋亡的机制涉及机体对线粒体凋亡途径重要分子Bcl-2的调控。