研究背景创面愈合是一个动态且受到严格精准调控的生物学过程。再上皮化主要涵盖表皮细胞向创面中心迁移的过程,是创面愈合的关键环节。Tetraspanin CD9表达于皮肤表皮中且我们前期通过动物实验研究发现CD9基因敲除小鼠皮肤创面愈合速度明显受抑制,表明CD9参与皮肤创面愈合的调控。然而,皮肤损伤后可激活多条细胞内及细胞间的信号通路,且包括角质化细胞,炎性细胞,内皮细胞,成纤维细胞等在内的多种细胞类型也会被调动参与创面愈合过程。这些细胞均会在基因表达或细胞表型上发生改变,促进细胞增殖、迁移或分化等过程,以参与创面愈合过程。因此,CD9是否通过调节表皮细胞迁移及其胞内信号通路介导创面愈合调控仍不清楚。大量研究表明基质金属蛋白酶(MMP-9)参与创面愈合过程中表皮细胞迁移的调控。我们前期研究结果也表明CD9下调可通过激活MMP-9介导表皮细胞迁移的调节。Tetraspanins分子家族的重要特征之一就是同整合素分子结合,并启动下游信号通路。CD9也被发现在创面愈合过程中受到严密的调控并参与整合素分子的调节。整合素αvβ6被证明可促进角膜创面愈合、上调MMP-9并可促进正常口腔黏膜表皮细胞迁移。有证据表明皮肤创面愈合过程中再上皮化过程同整合素αvβ5及αvβ6间的转换有关。此外,在创面愈合过程中或皮肤表皮细胞角化过程中,表皮细胞均存在分化状态及运动性间平衡的调节。而我们前期研究也证明CD9可通过在创面愈合不同的阶段的差异性表达介导表皮细胞迁移的调节。虽然CD9被证明参与创面再上皮化过程且在皮肤创面愈合过程中其表达水平受严格的时空调控,即创面形成后其表达明显下调,当创面再上皮化完成时其表达又恢复至正常皮肤表皮中水平,然而CD9在创面愈合过程其表达调控的具体机制也仍不清楚。事实上,急性皮肤组织损伤后创面微环境呈低氧环境且创缘组织氧浓度的这一变化过程同创面愈合过程中CD9的表达变化成良好的契合。因此,本研究将检测CD9对表皮细胞迁移的影响,并进一步探讨创面愈合过程中CD9对表皮细胞中MMP-9表达的调节以及整合素在其中的作用;同时,也将从表皮细胞分化状态及运动性间平衡的角度探讨CD9对表皮细胞移行的调控作用。此外,我们还将通过建立体外表皮细胞缺氧模型,明确创面愈合过程中cd9表达变化的分子机制,从而揭示cd9调节创面表皮细胞移行的作用机理,为揭示创面愈合规律的认识提供新的视角。研究方法1.利用小鼠皮肤制作在体创面愈合模型,同时使用hacat表皮细胞及正常人皮肤角质化细胞片层划痕制作体外细胞创面愈合模型。使用免疫荧光染色检测创缘移行表皮细胞中cd9的表达变化。使用重组腺病毒转染技术制作cd9高表达或干扰表达的表皮细胞模型,然后进行划痕检测及细胞迁移分析以观察cd9对表皮细胞迁移的影响。此外,还利用明胶酶谱法及elisa法检测cd9调控的表皮细胞培养上清液中mmp-9的活性变化,并利用蛋白免疫印迹法检测细胞中mmp-9的表达变化。mmp-9的选择性抑制剂或sp600125(10μm)被用来处理表皮细胞,以检测mmp-9在cd9调节的表皮细胞迁移中的作用或用来检测jnk信号通路在cd9介导mmp-9调节中的作用。2.同上述方法制作cd9高表达或干扰表达的hacat表皮细胞模型,然后运用wb法检测cd9调控后的hacat表皮细胞中整合素亚基的表达变化。同时提取hacat表皮细胞的细胞膜蛋白使用免疫共沉淀技术检测整合素亚基间的结合变化。免疫荧光染色及流式细胞学技术均被用来检测表皮细胞膜上整合素αvβ5及αvβ6的分布变化。另外,整合素功能阻断剂10d5和p1f6(10μg/ml)也被分别用来观察整合素αvβ5或αvβ6在cd9介导的表皮细胞mmp-9激活及迁移中的作用。3.hacat表皮细胞及原代小鼠皮肤表皮细胞(mks)进行高钙处理(1.2mm)24h建立表皮细胞分化模型,然后使用wb法检测cd9的表达变化。使用活细胞工作站动态拍摄技术观察单个表皮细胞的运动性,并使用imagej软件进行分析;cd9高表达或干扰表达mks分别于低钙或高钙条件下培养24h,观察cd9对表皮细胞直径及铺展面积的影响,同时使用wb法检测分化标记物(ck1,ck10,loricrin和filaggrin)的表达变化。免疫荧光染色被用来观察e-cadherin介导的细胞间粘附,而wb法及ip技术被用来检测cd9调控的表皮细胞中pi3k信号通路激活情况。使用e-cadherinsirna或ly294002处理低钙条件培养的cd9高表达表皮细胞,以观察其对cd9调控的表皮细胞分化及运动性的影响。使用jnk信号通路抑制剂sp600125处理cd9干扰表达的表皮细胞以检测jnk信号通路在e-cadherin向细胞膜上募集中的作用。此外,ihc法观察ck10及e-cadherin在cd9基因敲除的小鼠皮肤表皮细胞膜上表达变化。4.hacat表皮细胞及原代小鼠皮肤表皮细胞(mks)进行缺氧处理(2%o2)12h、24h及36h,然后使用wb及real-timepcr技术检测cd9水平变化。重组腺病毒转染技术制作cd9高表达或干扰表达的hacat表皮细胞模型再进行缺氧处理,然后使用划痕法及活细胞工作站动态摄像技术观察cd9对缺氧hacat细胞的作用。wb法检测p38/mapk信号通路激活情况并使用sb203580或mkk6(glu)转染调节缺氧表皮细胞中p38/mapk信号通路后,wb法检测cd9表达变化。同时使用细胞划痕分析及细胞迁移分析法检测p38/mapk信号通路在cd9调节的缺氧表皮细胞迁移中的作用。结果1.在体或离体创面愈合模型中创缘移行表皮细胞中cd9的表达均下调,且cd9的下调表达可促进表皮细胞移行,而cd9的高表达作用则相反。cd9可负向调控表皮细胞中mmp-9的活性及蛋白水平。cd9低表达激活的jnk信号通路也参与上调表皮细胞中mmp-9的活性及表达,而sp600125抑制jnk信号通路后却可使cd9干扰的表皮细胞中mmp-9活性及蛋白水平下调。2.cd9可调节表皮细胞中β5和β6的表达,且cd9干扰后可促进表皮细胞中αvβ5向αvβ6的转换,而cd9高表达却可逆转这一转换过程。使用10d5对整合素αvβ6进行功能阻断后可显著抑制cd9下调诱导的表皮细胞迁移及mmp-9激活。3.分化的表皮细胞中cd9的表达明显提高;且cd9高表达可促进表皮细胞分化并抑制其运动性;而cd9干扰后可抑制高钙诱导的表皮细胞分化过程并提高细胞的运动性。cd9上调后可促进e-cadherin向细胞膜上募集并激活下游pi3k信号通路,而cd9干扰后可抑制这一过程。另外,e-cadherin干扰后或pi3k信号通路受抑后均可逆转cd9上调诱导的表皮细胞分化及运动性下降。4.缺氧可下调cd9在表皮细胞中的表达水平并促进细胞迁移;而cd9高表达可抑制缺氧促进的表皮细胞迁移作用。缺氧还可激活p38/mapk信号通路;使用sb203580可上调表皮细胞中cd9的蛋白水平并下调缺氧条件下表皮细胞的迁移速率;而使用mkk6(glu)腺病毒转染促进p38/mapk信号通路激活后,却可使cd9表达下调并促进缺氧条件下表皮细胞的迁移。结论1.cd9在体内及体外创面愈合模型的移行表皮细胞中均呈下调表达,且cd9的低表达可促进表皮细胞的迁移,mmp-9参与了cd9介导的表皮细胞迁移调控,激活jnk通路可使mmp-9活化,显著促进cd9介导的表皮细胞迁移。2.下调cd9表达可促进皮肤表皮细胞中整合素ανβ5向ανβ6的转化,而整合素αvβ5和αvβ6间的转换在cd9介导的表皮细胞迁移及mmp-9激活调节过程中均起重要作用。3.CD9可调控表皮细胞分化状态及运动性间的平衡,且其介导的E-cadherin向细胞膜上的募集及下游PI3K信号的激活在这一过程中起重要调节作用。4.缺氧可明显下调表皮细胞中CD9的表达而促进表皮细胞迁移,p38通路在CD9介导缺氧诱导的表皮细胞迁移调控中起重要作用。本研究深化了对CD9在创面愈合中作用的认识,也为揭示创面愈合规律提供了新的视角,并为创面愈合的临床治疗提供了新的可能的分子靶点。