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背景：雌激素水平下降导致骨形成和骨吸收失衡是诱发绝经后骨质疏松症发生发展的主要机制。绝经后骨质疏松症可引起骨的脆性增加和骨的强度降低，并最终导致容易发生骨折，严重影响中老年妇女的健康。恢复和维持骨形成与骨吸收的平衡是目前骨质疏松研究和治疗的焦点。之前的研究主要集中在抑制破骨细胞活性以减少骨吸收，但近年来成骨细胞的分化或凋亡异常导致骨量减少越来越受到人们的重视。骨质疏松症的研究方向已逐渐从单一抑制破骨细胞活性转移至多向研究成骨细胞与破骨细胞的功能及其调控机制，以重新平衡骨形成与骨吸收过程。成骨细胞的功能恢复和数目维持已成为目前骨质疏松症治疗的研究重点。因此，深入研究调控成骨细胞骨形成能力的分子机制，发现具有促成骨作用的药物靶点，将会为绝经后骨质疏松症的治疗提供新的策略和新的方法。Orai1是最近发现和鉴定的介导细胞受体依赖型钙离子内流的钙通道，是一个四次跨膜蛋白。研究发现敲除小鼠Orai1基因后，小鼠出现体型减小、骨皮质变薄、松质骨减少等成骨不全症状，提示钙通道Orai1的异常可能参与骨形成过程。然而Orai1介导骨形成的具体分子机制尚未见报道。本研究从Orai1调控成骨细胞的分化与凋亡入手，深入探讨Orai1调控骨形成的分子机制。该研究明确了Orai1在骨形成方面的作用及其机制，可为临床骨质疏松症的治疗提供新的药物靶点和新的策略。目的：阐明Orai1调控成骨细胞分化与凋亡参与绝经后骨质疏松症发生发展的机制方法：1.通过去势法构建小鼠绝经后骨质疏松症模型，检测成骨细胞Orai1表达与钙离子内流变化；通过构建Orai1稳定knockdown细胞模型，检测成骨关键指标ALP、OCN、OPN、Runx2和Osterix转录及ALP活性和钙结节形成能力，并检测钙离子依赖的Ras-ERK1/2与CaMKII-NF-ATc信号通路活性，明确Orai1是否参与调控成骨细胞骨形成过程。2.17β-E2刺激小鼠MC3T3-E1细胞，检测Orai1蛋白表达与mRNA转录水平，并检测AKT-mTOR信号通路活性；应用特异性抑制剂抑制AKT与mTOR活性后，检测17β-E2对Orai1蛋白表达与mRNA转录水平的影响，明确雌激素调控Orai1的机制。17β-E2诱导Orai1knockdown细胞模型成骨，检测成骨关键指标ALP、OCN、OPN、Runx2和Osterix转录及ALP活性和钙结节形成能力，并检测钙离子依赖的Ras与CaMKII信号通路活性，明确雌激素可否通过Orai1促进成骨细胞分化。3. Tg诱导成骨细胞内质网应激后，检测17β-E2对细胞凋亡、Caspase-12和Caspase-3的活性及内质网应激标志性分子Grp78与CHOP表达的影响，明确17β-E2可否抑制内质网应激诱导成骨细胞凋亡过程。内质网应激条件下检测17β-E2对调控Grp78转录的关键转录因子ATF6、YY1、IRE1和TFII-I及Ras-ERK1/2信号通路影响，明确17β-E2抑制内质网应激诱导成骨细胞凋亡的分子机制。4. BMP2诱导Orai1knockdown细胞模型成骨，检测成骨关键指标ALP、OCN、OPN、Runx2和Osterix转录及ALP活性和钙结节形成能力，并检测钙离子依赖的Ras与CaMKII信号通路活性，明确BMP2可否通过Orai1促进骨形成。BMP2诱导细胞成骨分化后，检测调控Orai1表达或活性的关键信号分子活性，并加入相应信号通路抑制剂，明确BMP2调控Orai1的分子机制。结果：1.我们应用去势法构建小鼠绝经后骨质疏松症模型并发现绝经后骨质疏松症小鼠成骨细胞Orai1表达下降并且钙离子内流减少。接着我们应用shRNA干扰技术在人MG63和鼠MC3T3-E1细胞中成功构建Orai1稳定knockdown细胞模型，我们发现抑制Orai1的表达后，成骨关键指标ALP、OCN、OPN的转录以及ALP活性和钙结节形成能力均下降，并且调控成骨细胞分化的特异性转录因子Runx2和Osterix转录以及钙离子依赖的Ras-ERK1/2与CaMKII-NF-ATc信号通路活性也显著抑制，提示Orai1通过促进钙离子内流激活Ras-ERK1/2与CaMKII-NF-ATc信号通路促进成骨细胞骨形成过程。2.我们用17β-E2刺激MC3T3-E1细胞发现Orai1蛋白表达与mRNA转录水平呈时间依赖性增加，并且发现17β-E2可明显促进AKT与mTOR的活性增加。我们用特异性抑制剂抑制AKT与mTOR活性后，阻断了17β-E2促进成骨细胞Orai1表达的作用，提示17β-E2通过激活AKT-mTOR信号通路促进成骨细胞Orai1的表达。初步揭示了雌激素降低导致成骨细胞Orai1表达降低的分子机制。我们还发现抑制Orai1表达可明显阻断17β-E2促进成骨关键指标ALP、OCN、OPN的转录以及促进ALP活性和钙结节形成能力的作用，并阻断17β-E2促进成骨细胞分化的特异性转录因子Runx2和Osterix转录以及激活Ras与CaMKII信号通路的作用，提示17β-E2通过促进Orai1表达促进成骨细胞成骨分化。3.我们发现在内质网应激条件下17β-E2通过促进Grp78表达，抑制Caspase-12和Caspase-3的活性抑制内质网应激诱导的成骨细胞凋亡。我们进一步研究发现17β-E2通过促进Orai1表达，激活Ras-ERK1/2信号通路，促进TFII-I的磷酸化并入核与Grp78启动子区结合，促进Grp78表达。该研究揭示了Orai1参与调控成骨细胞凋亡的分子机制。4.我们发现在BMP2促成骨诱导条件下，下调Orai1表达可抑制成骨特异性转录因子Runx2和Osterix的转录，并进一步抑制成骨标志性分子ALP、OCN和OPN的转录，从而抑制了成骨细胞的成骨分化能力。我们还发现下调Orai1表达可抑制BMP2促进的钙离子内流以及钙离子依赖的Ras和CaMKII信号通路的激活，从而抑制成骨特异性转录因子Runx2和Osterix转录，以及成骨标志性分子ALP、OCN和OPN的转录。进一步研究发现BMP2通过激活Integrinβ1-FAK-Src信号通路促进Orai1活化和钙离子内流以及Ras和CaMKII信号通路的激活，促进成骨细胞的分化和细胞外矿物钙化过程。并且证实Integrinβ1与BMP2受体BMPR-I和BMPR-II在细胞膜上存在直接的相互作用。初步揭示了BMP2调控Orai1活性促进成骨细胞分化的分子机制。结论：综上所述，我们发现绝经后由于雌激素水平下降，AKT-mTOR信号通路活性降低导致Orai1表达下降。Orai1表达下降后一方面抑制了BMP2的促成骨作用，另一方面增加成骨细胞的凋亡，从而导致骨质疏松症的发生。该研究初步阐明了Orai1在骨形成方面的作用及其机制，可为临床骨质疏松症的治疗提供新的策略和药物靶点。