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云芝糖肽(Polysaccharidiopeptide, PSP)是从云芝Cov-1菌株的液体发酵菌丝体中提取得到的一种多糖肽聚合物,具有显著提高机体免疫功能的作用,临床应用于肿瘤的辅助治疗。本文通过色谱条件优化建立了云芝糖肽单糖组成HPLC分析方法,并结合利用云芝糖肽法定质量标准中的质量指标和检测方法,进行了云芝糖肽培养基优化的研究,以期提高云芝糖肽的产量,降低生产成本。在考察色谱柱、流动相组成和流动相pH对单糖PMP衍生化物分离效果的基础上,建立了一种柱前衍生化HPLC分析云芝糖肽七种单糖组成的方法,即采用LunaC18(250×4.60mm,5μm，phenomenex)色谱柱,以乙腈(A)-0.05mol/L磷酸缓冲液(KH2PO4-NaOH, pH7.1, B)(18:82)为流动相；柱温30℃；流速1.0mL/min;检测波长为254nm；进样体积20μL。在此色谱条件下,甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖的分离度分别为5.92、9.24、11.37、3.72、1.60、1.21、4.20。通过对酸的浓度、酸水解温度和酸水解时间的考察,优化得到了多糖水解条件,即取2.5mg云芝糖肽置于5mL安瓿中,加入4mol/L三氟乙酸,于120℃水解6小时。水解产物在碱性溶液中与PMP-甲醇溶液于70℃水浴反应1h,得到单糖衍生化物。在对云芝糖肽质量标准中测定糖含量的苯酚-硫酸法进行方法学验证,结果表明线性良好、精密度高、稳定性好、加样回收率高、辅料对其无干扰。对蛋白质含量测定方法和分子量分布测定方法进行复核的基础上,进行了多批云芝糖肽产品的检测,了解了云芝糖肽的质量情况。运用建立的柱前衍生化HPLC方法分析了十批次云芝糖肽原料和云芝糖肽胶囊以及从不同云芝菌株、云芝的不同部位、甚至不同真菌提取的多糖肽的单糖组成,结果表明：云芝糖肽原料与胶囊制剂的单糖组成相对稳定,其中云芝糖肽的单糖组成为甘露糖：D-盐酸氨基葡萄糖：鼠李糖：葡萄糖：木糖：半乳糖：阿拉伯糖：岩藻糖=112.1±16.50：6.32±2.68：14.46±2.42：100：54.26±10.36：19.74±10.72：13.31±4.94：34.73±3.57：云芝糖肽胶囊的单糖组成为甘露糖：D-盐酸氨基葡萄糖：鼠李糖：葡萄糖：木糖：半乳糖：阿拉伯糖：岩藻糖=84.75±8.87：9.68±3.02：15.68±2.27：100：34.43±2.34：9.56±1.30：8.01±2.09：35.45±4.90。不同云芝菌株来源的多糖肽、云芝多糖(子实体多糖)、云芝胞内糖肽(菌丝体糖肽)、猪苓糖肽和鸡腿菇糖肽均具有相似的单糖种类和不同的单糖组成比例。由此说明,每一种多糖肽均有其单糖组成特性,柱前衍生化HPLC单糖组成分析方法可以用于云芝糖肽的检测,通过增加制定云芝糖肽的单糖摩尔比质量指标进一步控制云芝糖肽的质量。通过考察培养基的碳氮总量、碳氮比例以及不同碳源对于云芝糖肽产量和质量的影响,优化了云芝糖肽的发酵培养基。其中最优液体发酵培养基为葡萄糖4.8%、黄豆饼粉1.9%、酵母粉0.2%. KH2PO40.05%. MgSO40.05%, pH自然,培养基的碳氮总量为6.9%,碳氮比例为17：1。在此条件下云芝菌丝体产量达到19.06g/L,云芝糖肽得率为3.18g/L,云芝糖肽的糖含量为36.22%,蛋白含量为28.54%,分子量大于等于40000道尔顿的百分比例为53.36%,云芝糖肽的单糖组成为甘露糖、D-盐酸氨基葡萄糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖。对不同碳源进行考察的结果为：小分子碳源乳糖,天然碳源玉米粉、小麦粉能显著提高云芝菌丝体产量和云芝糖肽得率,其中菌丝体产量分别为：19.56g/L、21.69g/L和21.20g/L；云芝糖肽得率分别为：2.94g/L、2.84g/L和2.91g/L。小分子碳源蔗糖、麦芽糖和麦芽糊精作为葡萄糖的替代碳源,可以在降低成本的同时保证云芝菌丝体产量以及云芝糖肽产量、质量。在考察不同碳氮比对云芝糖肽的影响中发现,随着碳氮比的增加,云芝糖肽中葡萄糖比例逐步增加,即通过调整培养基的碳氮比不仅可以调节云芝糖肽的产量,也可能调整云芝糖肽的单糖组成。对碳氮总量、碳氮比例、碳源进行三因素三水平正交试验,结果表明以菌丝体产量作为检验指标具有显著差异性,最优培养基配比为：碳氮总量8%,碳氮比例13.5：1,最佳碳源为玉米粉。在该条件下,菌丝体产量为27.08g/L,糖肽得率为3.73g/L,分别是传统方法的2.11倍和2.11倍。云芝糖肽中糖含量为38.95%,蛋白含量为31.04%。