金黄色葡萄球菌作为一种常见且典型的食源性病原菌,可经饮水和食物摄入等途径感染人体,其感染发病率高,对人体健康危害较大。因此,对金黄色葡萄球菌进行快速、准确检测对于预防和控制因其引起的食源性疾病暴发流行具有重要意义。目前,对金黄色葡萄球菌的检测主要依靠分离培养法、免疫学方法和分子生物学方法。然而上述方法均需要经过前增菌或选择性培养等前处理过程,影响检测的灵敏度和准确性,且费时、费力。本课题针对现有检测方法样本分离、富集等前处理复杂、费时等问题,设计、制备不同类型的新型金黄色葡萄球菌印迹聚合物膜用于病原菌的快速分离与富集,并构建不同类型的荧光检测探针,利用荧光分光光度计实现对金黄色葡萄球菌的灵敏、准确、快速检测,为金黄色葡萄球菌检测提供一定的理论与技术支持。第一部分:基于氟化物修饰印迹聚合物膜的金黄色葡萄球菌检测方法的建立与评价目的:制备1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷修饰的印迹聚二甲基硅氧烷膜用于分离富集待检样品中的金黄色葡萄球菌,结合淬灭-恢复型荧光探针的灵敏性荧光信号,构建对金黄色葡萄球菌的快速检测方法。方法:1.设计、制备以聚二甲基硅氧烷为印迹基底,以金黄色葡萄球菌为模板的印迹聚合物膜,进一步采用气相沉积法,在膜表面修饰1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷,得到以聚二甲基硅氧烷为印迹基底的氟化物修饰的金黄色葡萄球菌印迹膜。对氟化物修饰印迹膜的尺寸、表面形貌、组成成分、疏水性及捕获效率进行表征。2.制备多巴胺修饰金纳米粒子,并对其形貌、粒径、紫外-可见吸收光谱和表面电荷进行表征。3.制备柠檬酸修饰铜纳米簇,并以金黄色葡萄球菌的表面电位为依据,优化柠檬酸的最佳用量。对柠檬酸修饰铜纳米簇的形貌、粒径、紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱、含有的基团以及表面电荷进行表征。4.构建以多巴胺修饰金纳米粒子和柠檬酸修饰铜纳米簇为基础的淬灭-恢复型荧光探针。对多巴胺修饰金纳米粒子和柠檬酸修饰铜纳米簇的反应最佳用量及反应时间进行优化。5.以氟化物修饰印迹膜为分离器捕获金黄色葡萄球菌,以淬灭-恢复型荧光探针为报告探针,建立对金黄色葡萄球菌的快速检测方法并对检测效果进行评价。6.对牛奶模拟样品进行不同浓度的金黄色葡萄球菌加标回收实验,评价该方法在实际应用中的可行性。结果:1.所制备的氟化物修饰印迹膜呈透明状,厚度约2 mm,表面的孔穴直径为0.76μm。氟化物修饰印迹膜含有Si-OH,Si-O-Si和Si-CH2和O-CO-O的特征峰,由C、O、Si和F四种元素组成,表面呈疏水性。该膜对金黄色葡萄球菌具有较好的特异性,捕获效率达到83.3%。2.所制备的多巴胺修饰金纳米粒子呈球形,分散性良好,其粒径为23.96±0.73 nm,在522 nm处有特征吸收峰,表面电荷为2.89±0.12 m V。3.所制备的柠檬酸修饰铜纳米簇中最佳柠檬酸用量为60 mg。柠檬酸修饰铜纳米簇呈球形,分散性良好且粒径均一,平均粒径为8.54±0.35 nm。与未修饰的铜纳米簇比较,柠檬酸修饰铜纳米簇的紫外-可见吸收光谱发生了红移,并且于490 nm处显示出强烈的荧光发射峰。柠檬酸修饰铜纳米簇含有O-H,N-H,C-N,C=O和C-C的特征峰,表面电荷为-43.92±0.5 m V。4.通过对多巴胺修饰金纳米粒子的紫外-可见吸收光谱和柠檬酸修饰铜纳米簇的荧光发射光谱研究发现,二者有明显的重叠,证明淬灭-恢复型荧光探针可以建立。对二者的混合物进行透射电镜表征,多巴胺修饰金纳米粒子和柠檬酸修饰铜纳米簇间相互作用紧密,证明淬灭-恢复型荧光探针已成功建立。多巴胺修饰金纳米粒子的最佳用量为800μL,柠檬酸修饰铜纳米簇的用量为200μL,荧光淬灭时间为1 min,荧光恢复时间为15 min。5.利用本研究所建立的检测方法对金黄色葡萄球菌的检出限为11.1CFU·m L-1,检测范围为1.0×10~1CFU·m L-1～1.0×10~7 CFU·m L-1,线性回归方程为Y=0.127X+0.106,R~2=0.973。以国家标准《食品中致病菌限量》中规定的食品必检的食源性病原菌为干扰菌株证明了该方法具有较好的特异性。6.对牛奶模拟样品中金黄色葡萄球菌的加标回收率为98.3%-101.7%,相对标准偏差为5.0%-8.8%,表明本方法具有在模拟样品中检测金黄色葡萄球菌的可行性,且抗干扰能力较强。结论:1.本章研究以金黄色葡萄球菌为印迹模板,成功制备了氟化物修饰细菌印迹膜,可特异性识别并捕获金黄色葡萄球菌。2.制备了多巴胺修饰金纳米粒子与柠檬酸修饰的铜纳米簇,并以二者为基础构建了淬灭-恢复型荧光探针。3.研究以氟化物修饰印迹膜为金黄色葡萄球菌分离器,以淬灭-恢复型荧光探针为细菌信号报告探针,成功开发了一种金黄色葡萄球菌的比较灵敏、准确的检测方法,该方法具有良好的特异性。4.该检测方法具有在模拟样品中检测金黄色葡萄球菌的可行性。第二部分:基于N-丁二酰-壳聚糖掺杂的生物印迹复合膜的金黄色葡萄球菌检测方法的建立与评价目的:在第一部分的印迹膜的基础上对其进行改造,制备N-丁二酰-壳聚糖掺杂的氟化物修饰印迹复合膜以分离金黄色葡萄球菌,基于带正电荷的半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子对金黄色葡萄球菌的吸附和其自身的聚集诱导发光效应,建立对金黄色葡萄球菌的快速检测方法。方法:1.设计、制备以N-丁二酰-壳聚糖掺杂的聚二甲基硅氧烷为印迹基底,以金黄色葡萄球菌为印迹模板的印迹聚合物膜,并在膜表面修饰1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷,得到以N-丁二酰-壳聚糖掺杂的聚二甲基硅氧烷为印迹基底的氟化物修饰金黄色葡萄球菌印迹复合膜。对氟化物修饰生物印迹复合膜的尺寸、表面形貌、组成成分、疏水性及捕获效率进行表征。2.采用还原法合成半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子,并对其形貌、粒径、Au元素价态、紫外-可见吸收光谱、聚集诱导发光效应、荧光寿命及表面电荷进行表征。3.对N-丁二酰-壳聚糖的用量进行优化,使印迹复合膜对细菌具有良好的捕获性能;对半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子的用量及反应时间进行优化,使体系的荧光信号能够准确反映细菌浓度;对乙醇的体积分数进行优化,使半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子聚集诱导发光效应产生最高的荧光强度。4.以氟化物修饰生物印迹复合膜为分离器,以具有聚集诱导发光特性的半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子为报告探针,构建对金黄色葡萄球菌的灵敏性检测方法,并对检测效果进行评价。5.使用本方法对牛奶样品以及南湖水样进行检测,并与国标平板法比较,评价建立的方法对实际食品样品和南湖水样检测的可行性。结果:1.所制备的氟化物修饰生物印迹复合膜呈乳白色,具有透光性,膜的厚度为2 mm,表面的孔穴直径为0.78μm。该膜含有Si-CH2、Si-O-Si和Si-OH的特征峰,由C、O、Si和F四种元素组成,表面呈疏水性。复合膜对金黄色葡萄球菌有良好的特异性,捕获效率达到85.4%。2.半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子呈小型团簇状,粒径为115±2.35 nm,仅含有Au（I）状态的Au元素。与纳米簇前体比较,半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子的紫外-可见吸收光谱发生增色位移,在598 nm处有特征的荧光发射峰。向其中加入无水乙醇后,纳米粒子的荧光强度大幅增加,同时荧光寿命延长至6.01μs,表明半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子具有良好的聚集诱导发光效应。半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子表面电荷为24.62±2.93 m V。3.最佳N-丁二酰-壳聚糖用量与聚二甲基硅氧烷的质量比为1:4000。半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子的最佳用量为400μL,最佳反应时间为30 min。最佳乙醇体积分数为30%。4.本研究所建立的检测方法对金黄色葡萄球菌的检出限为6.9 CFU·m L-1,检测范围为1.0×10~1CFU·m L-1～1.0×10~6 CFU·m L-1,线性回归方程为Y=1.211-0.170X,R~2=0.961。以国家标准《食品中致病菌限量》中规定的食品必检的食源性病原菌为干扰菌株证明了该方法具有较好的特异性。5.与国标平板法比较,本方法对牛奶样品和南湖水样中金黄色葡萄球菌的回收率为99.6%-99.9%,相对标准偏差为3.2%-7.5%,表明该方法在实际食品样品检测中具有较好的可行性。此外,该方法也可拓展到环境水样检测。结论:1.制备了N-丁二酰-壳聚糖掺杂的氟化物修饰生物印迹复合膜,可特异性识别并捕获金黄色葡萄球菌。与第一部分的印迹膜比较,复合膜的捕获性能有所提升。2.半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子探针具有聚集诱导发光性质和良好的荧光性能,可实现对金黄色葡萄球菌浓度信号的灵敏性反应。3.本部分以氟化物修饰生物印迹复合膜为金黄色葡萄球菌分离器,以带有聚集诱导发光性质的半胱胺盐酸盐修饰金纳米粒子为细菌信号报告探针,构建了金黄色葡萄球菌比较灵敏、准确、特异的检测方法。4.本方法具有对复杂基质实际样品较好的实用性与可靠性,可以实现对食品样品的良好检测,也可以扩展应用到环境水样的检测。第三部分:基于多壁碳纳米管修饰的生物印迹膜的金黄色葡萄球菌检测方法的建立与评价目的:制备多壁碳纳米管修饰印迹膜以分离金黄色葡萄球菌,多壁碳纳米管的修饰过程条件温和、操作简单,摆脱了氟化物的高温修饰,以具有硝基还原酶和过氧化物酶活性的正电荷共价复合纳米酶为报告探针,建立对金黄色葡萄球菌的荧光和比色双重信号检测方法。方法:1.设计、制备以聚二甲基硅氧烷为印迹基底,以金黄色葡萄球菌为模板的印迹聚合物膜,然后在膜表面修饰多壁碳纳米管,得到以聚二甲基硅氧烷为印迹基底的多壁碳纳米管修饰金黄色葡萄球菌印迹膜。对多壁碳纳米管修饰印迹膜的尺寸、表面形貌、组成成分、疏水性、捕获效率及抗污性能进行表征。2.制备共价复合纳米酶,并对其形貌、粒径、元素组成、紫外-可见吸收光谱、表面电荷、硝基还原酶活性、过氧化物酶活性、酶动力学参数进行表征。3.优化多壁碳纳米管的浓度,使印迹膜达到对金黄色葡萄球菌的最佳捕获效率;优化对苯二胺的用量,使纳米酶与金黄色葡萄球菌间具有最强的相互作用力。共价复合纳米酶具有双重酶活性,建立的方法可以通过荧光和比色双重信号对目标菌进行检出。对荧光和比色检测体系的条件优化如下:1)荧光检测体系:共价复合纳米酶反应浓度的优化;共价复合纳米酶反应体积的优化;共价复合纳米酶与金黄色葡萄球菌反应时间的优化;共价复合纳米酶与4-硝基-1,8-萘二甲酸酐的反应时间优化;2)比色检测体系:共价复合纳米酶反应浓度的优化;共价复合纳米酶反应体积的优化;共价复合纳米酶与金黄色葡萄球菌反应时间的优化。4.以多壁碳纳米管修饰印迹膜为分离器,以具有硝基还原酶活性和过氧化物酶活性的共价复合纳米酶作为信号报告探针,构建对金黄色葡萄球菌的荧光和比色双重信号检测方法,并对其检测效果进行评价。5.使用本方法对牛奶样品和南湖水样进行检测,并与国标平板法比较,评价建立的方法对实际样品检测的可行性。结果:1.多壁碳纳米管修饰印迹膜表面呈黑色,具有一定透光性,厚度为2 mm,表面的孔穴直径为0.78μm。多壁碳纳米管修饰印迹膜含有Si-CH2,Si-O-Si和Si-OH三个特征峰,由C、O、Si三种元素组成,膜的表面呈疏水性。印迹膜对金黄色葡萄球菌有良好的特异性,捕获效率达到87.2%,并具有良好的防污性能。2.共价复合纳米酶呈球形,表面有大量的金纳米粒子点缀以及块状的黑色沉积,粒径为687±9.67 nm。共价复合纳米酶主要由C、Au、Cl及Fe元素组成,表面电荷为44.85±2.09 m V。共价复合纳米酶具有良好的硝基还原酶活性,又具有良好的过氧化物酶活性,其对4-硝基-1,8-萘二甲酸酐的荧光放大倍数达到9.26倍;且能够快速氧化TMB产生蓝色底物,Km值为0.1783μM。3.多壁碳纳米管的最佳浓度为0.5 mg·m L-1,对苯二胺的最佳用量为50 mg。1)荧光信号检出体系:共价复合纳米酶的最佳反应浓度为2μg·m L-1,最佳反应体积为400μL,与金黄色葡萄球菌的最佳反应时间为3 min,与4-硝基-1,8-萘二甲酸酐的最佳反应时间为30 min;2)比色信号检出体系:共价复合纳米酶的最佳反应浓度为40μg·m L-1,最佳反应体积为300μL,与金黄色葡萄球菌的最佳反应时间为3 min。4.依据探针的硝基还原酶活性建立的荧光检测体系对金黄色葡萄球菌的检出限为7.9 CFU·m L-1,检测范围为1.0×10~1CFU·m L-1～1.0×10~7 CFU·m L-1,线性回归方程为Y=0.8988-0.1065X,R~2=0.980;依据探针的过氧化物酶活性建立的比色检测体系对金黄色葡萄球菌的检出限为8.5 CFU·m L-1,检测范围为1.0×10~1CFU·m L-1～1.0×10~7 CFU·m L-1,线性回归方程为Y=0.8963-0.0995X,R~2=0.999。以国家标准《食品中致病菌限量》中规定的食品必检的食源性病原菌为干扰菌株证明了该方法具有较好的特异性。5.与国标平板法比较,本方法建立的荧光检测体系对牛奶和南湖水样中金黄色葡萄球菌的回收率为98.1%-101.7%,相对标准偏差为7.6%-7.8%,建立的比色检测体系对牛奶和南湖水样中金黄色葡萄球菌的回收率为98.6%-102.2%,相对标准偏差为5.8%-8.4%,表明该方法在实际样品检测时具有较好的可行性。结论:1.本章以金黄色葡萄球菌为模板,制备了多壁碳纳米管修饰的金黄色葡萄球菌印迹膜,可较好捕获并特异性识别金黄色葡萄球菌。与前两部分的印迹膜比较,多壁碳纳米管修饰的印迹膜捕获性能进一步提升;此外,该膜还具有良好的防污抗污的性能。2.制备了同时具有良好硝基还原酶活性和过氧化物酶活性的共价复合纳米酶,可将4-硝基-1,8-萘二甲酸酐的硝基还原成为氨基使其带有荧光,通过检测荧光强度实现定量,同时也可在过氧化氢存在的条件下氧化TMB成TMB2+,通过目视显色进行定性以及通过测定吸光度进行定量。3.研究以多壁碳纳米管修饰印迹膜为金黄色葡萄球菌分离器,以共价复合纳米酶为细菌信号报告探针,构建了一种双重信号检测金黄色葡萄球菌的灵敏、准确、特异的检测方法。4.本方法具有良好的实用性与可靠性,可以应用于食品样品的检测,也可以扩展应用到环境样品的检测,具有应用层面的广谱性。