急性肝功能衰竭(acute hepatic failure, AHF)是原来无肝病者肝脏受损后短时间内发生的严重临床综合征,发病急,死亡率高达80%,最常见的病因是病毒性肝炎。中国每年约有30至50万病人最终死于肝脏衰竭。目前尚无特效治疗方法,临床最有效的治疗方法是肝移植,但由于供肝的短缺,限制了肝移植的广泛应用。大部分急性肝衰竭的患者在等待肝移植的过程中死亡,因此研制可以替代肝脏功能的机器,使急性肝功能衰竭患者可以过渡到肝移植或肝细胞再生恢复其正常功能有重要意义。人工肝是治疗肝衰竭患者的有效途径。近年来,人工肝脏的研究取得了具大的进展,从早期的机械型人工肝发展到生物型人工肝,再到如今的混合型生物人工肝。目前报道的生物人工肝系统包括：ELAD (Extracorporeal Liver Assist Device)、HepatAssist2000、MELS (Modular Extracorporeal Liver Support)、BLSS (Bio-artificial Liver Support System)、AMC-BAL (Amsterdam Medical Centre-BAL)、HBLSS等,但大部分尚处于试验阶段,没有真正的进入临床应用。本课题组经过多年的努力,研发出了人工肝支持系统的原理型样机和商品化样机,并通过西藏小型猪和猴子的实验验证了机器的稳定性和安全性,本课题组在原有原理型样机和商品化样机的基础上,通过对机电系统,循环系统、控制系统和在线检测系统进行优化,并增加了冗余设计使机身更为小巧轻便,外观更加美观,开发出了新一代的人工肝支持系统临床型样机(ZHJ一2),其主要由双向灌流旋转式生物反应器、血浆分离器、血液灌流器、氧合器和加热器等组成；其具有独特的特点：①.具有多种功能(肝肾支持功能)；②.具有多种治疗模式；③.智能化、机能化,操作简捷、方便；④.体型变小,重量变轻,易于运输。主要包括以下内容：一：新型生物人工肝支持系统安全性的评估；二：新型生物人工肝支持系统有效性的评估。第一章新型生物人工肝支持系统的安全性评估第一节新型生物人工肝支持系统体外循环实验目的：通过新型生物人工肝支持系统的体外循环实验,初步评估该临床型样机的参数设定、系统稳定性和污染性,为大动物的体内循环实验奠定基础。方法：(1)管路的制作：根据机器各泵、相应夹管阀和监测系统的分布情况进行新型生物人工肝管路设计制作,设计出人工肝的不同治疗模式管路；(2)蠕动泵功能检测：将管路安装在各个蠕动泵上,分别设置50 ml/min、 100 ml/min的转动速率,动静脉管两端置入盛有生理盐水的量杯中,用生理盐水预充管路,同时将管路中的空气排空,然后把静脉端放入1L的量杯中,按压开始按钮,运行3分钟,用电子秤称量其重量,用来评估蠕动泵实际转运速率是否符合机器所设定的速率和并估算其精度；(3)利用局部法和整体法测定各种治疗模式管路以及血浆分离器、血液灌流器、生物反应器等的预充量；(4)通过密闭式水循环实验,评估机器各个报警系统是否正常工作,评估管路有无破膜、漏血和有无气泡产生等；并评估机器的耐力性及其污染性(连续运行120h)。(5)统计学方法：采用SPSS21.0统计软件进行处理,计量资料用χ±s表示,多样本间均数比较采用单向方差分析及t检验,检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：成功制作了不同治疗模式的管路；所有蠕动泵功能正常；预充量测定结果显示：血液灌流模式管路的预充量约为130ml,生物管路约为240ml,混合模式管路约为250ml,CRRT模式管路约为200ml,血浆分离器约为200ml,生物反应罐预充量约为250ml,血液灌流器约为200ml,氧合器约为50ml；血液灌流模式预充量约为530ml,生物模式预充量约为945ml,混合模式预充量约为950ml,CRRT模式预充量约为400ml。在密闭式水循环试验中,未发现气泡产生,未发现管路爆破,未见漏水等情况；各检测器(血容流不足检测器,漏血检测器和气泡检测器)均正常运行；机器在连续运行120h的过程中,机器耐受性良好,机器未出现故障(意外短路,突然停止等),各个压力值稳定,内毒素测定结果均<5.0 EU/ml；动、静脉端需氧、厌氧菌培养未见细菌生长,密闭式循环安全稳定。第二节新型生物人工肝支持系统体内循环实验目的：通过新型生物人工肝支持系统的体内循环实验进一步评估人工肝治疗模式的选择及参数设置、评估大动物实验的安全性和稳定性,为机器有效性的评估打下基础,提供技术支持。方法：(1)模型制备：动物购买后适应性喂养7天,实验前禁食12 h。采用速眠新Ⅱ肌肉注射诱导麻醉+股静脉持续泵入丙泊酚联合麻醉,麻醉后,平卧位并用绷带固定四肢,于腹股沟区和颈静脉区备皮、消毒铺单。切开皮肤和皮下组织,解剖分离股动静脉和颈静脉,然后行股动脉(深静脉管)和颈内静脉(血液透析双腔管)置管。(2)模型上机：西藏小型猪上机前,装载管路和滤器,并用肝素盐水循环半小时,然后用羟乙基淀粉预充管路,经股静脉双腔管给予地塞米松5 mg,非那根25 mg肌肉注射,经双腔管给予首剂肝素(250U/kg),打开肝素泵,按50U/kg.h追加肝素,时时监测APTT,根据APTT值调整肝素泵的速率。血泵流速设置为50 ml/min,分浆泵流速设置为15 ml/min,循环泵流速设置为15ml/min、反应器循环周期为75s。然后进行心电监护,监测实验中动物的生命体征(包括ECG、心率、呼吸频率和血氧饱和度)；每头模型猪上机治疗8小时,记录入浆壶压、静脉压和跨膜压(2h/次),时时监测西藏小型猪的动脉血压、血氧饱和度、心率、呼吸、心电图。治疗过程中,输入0.9%生理盐水100 ml进行冲管(2h/次),以防止滤器和管路堵塞,密切观察西藏小型猪的胸廓起伏和生命体征的变化,同时从实验开始第0、4h、8h股静脉采血行血培养、内毒素测定。实验猪下机后,继续观察实验猪的饮食、饮水和生命体征变化。(3)统计学方法：采用SPSS21.0统计软件进行处理,计量资料用χ±s表示,多样本间均数比较采用单向方差分析及t检验,检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：所有西藏小型猪均存活。实验中未见心电图、血压异常、出血、抽搐和发热等不良反应。治疗后未发现切口感染、出血和发热等并发症。机器在试验过程中运行正常,未发现管漏血、管路破裂和破膜等情况,在实验第0h、4h、8h取样进行内毒素检测的结果均小于0.5 EU/ml,血培养结果显示未发现细菌生长。西藏小型猪在实验过程中,各时间点血氧饱和度、呼吸频率均数间无显著性差异(P>0.05),第8 h血氧饱和度和呼吸频率与0 h相比有显著性差异P<0.05；第4 h心率和平均动脉与0h相比有显著性差异P<O.05,血氧饱和度、呼吸频率、平均动脉压和心率样本均数均能维持相对稳定状态。入浆壶压、静脉压及跨膜压均满足方差齐性,经方差分析发现静脉压6h、8h与0h比较差异有统计学意义(P<0.05)；跨膜压和入浆壶压各时间点与0h比较差异无统计学意义。第二章’新型生物人工肝支持系统有效性的评估目的：通过救治西藏小型猪和食蟹猴急性肾衰模型进一步对其安全性和有效性进行评估,为新型生物人工肝支持系统进入临床试验打下基础,提供经验。方法：(1)西藏小型猪肾衰模型构建：动物购买后适应性喂养7天,实验前禁食12 h。采用速眠新Ⅱ肌肉注射诱导麻醉+股静脉持续泵入丙泊酚联合麻醉,麻醉后,平卧位并用绷带固定四肢,于腹股沟区备皮、消毒铺单。切开皮肤和皮下组织,解剖分离股动静脉,然后行股静脉(血液透析双腔管)置管。进行膀胱造瘘以便于计算尿量,抽血进行肾功能(肌酐,尿素)检测,双侧肾区备皮消毒,用利多卡因行局部浸润麻醉,逐层打开腹腔,暴露双侧肾脏,解剖分离肾动脉,结扎双侧肾动脉；消毒关腹,将模型猪放入饲养室,给予补液,静待其苏醒,术后于12h和24h取血检测肾功能。人工肝上机治疗：西藏小型猪肾衰模型制备好后,模型猪上机前,所有管路和滤器先用肝素盐水循环半小时,再用羟乙基淀粉预充管路,给予静脉注射地米5mg和肌肉注射非那根25mg,经双腔管给予首剂肝素(250U/kg),打开肝素泵,按50U · kg-1 · h-1追加肝素,时时监测APTT,根据APTT值调整肝素菜的速率,治疗结束前半小时停止追加肝素。血泵流速设置为50ml/min,弃浆泵流速设置为10ml/min,返浆泵流速设置为5ml/min,补液泵流速设置为5ml/min,超滤率为20%。然后进行心电监护,监测实验中动物的生命体征(包括ECG、心率、呼吸频率和血氧饱和度)。每头模型猪上机治疗8小时,记录静脉压和跨膜压(2h/次),时时监测猪的动脉血压、血氧饱和度、心率、呼吸、ECG。治疗过程中,输入0.9%生理盐水100ml进行冲管(2h/次),以防止滤器和管路堵塞,密切观察猪的胸廓起伏、生命体征的变化。同时从实验开始第0、4h、8h股静脉采血行血培养、内毒素、肾功能和电解质检测。治疗结束后,继续观察实验猪饮食、饮水、生命体征变化。(2)食蟹猴肾衰模型的构建：动物购买后适应性喂养7天,实验前禁食12 h。采用氯胺酮肌肉注射诱导麻醉+气管插管异氟烷吸入联合麻醉,麻醉后,平卧位并用绷带固定四肢,于腹股沟区备皮、消毒铺单。切开皮肤和皮下组织,解剖分离股动静脉,然后行股静脉(血液透析双腔管)置管。进行膀胱造瘘以便于计算尿量,抽血进行肾功能(肌酐,尿素)检测,双侧肾区备皮消毒,用利多卡因行局部浸润麻醉,逐层打开腹腔,暴露双侧肾脏,解剖分离肾动脉,结扎双侧肾动脉；消毒关腹,将模型食蟹猴放入饲养室,给予补液,静待其苏醒,术后于12h和24h取血检测肾功能。人工肝上机治疗：食蟹猴肾衰模型制备好后,模型猴上机前,所有管路和滤器先用肝素盐水循环半小时,再用羟乙基淀粉预充管路,给予静脉注射地塞米松5mg和肌肉注射非那根25mg,经双腔管给予首剂肝素(250U/kg),打开肝素泵,按50U.kg-1·h-1追加肝素,监测活化APTT(2h/次),根据APTT值调整肝素泵的速率,治疗结束前半小时停止追加肝素。血泵流速设置为32ml/min,弃浆泵流速设置为8ml/min,返浆泵流速设置为4ml/min,补液泵流速设置为4ml/min,超滤率为25%。然后进行心电监护,监测实验中动物的生命体征(包括ECG、心率、呼吸频率和血氧饱和度)。每头模型猴治疗6小时,记录静脉压、跨膜压,动态监测食蟹猴的动脉血压、血氧饱和度、心率、呼吸、心电图。治疗过程中,密切注意食蟹猴的胸廓起伏、生命体征的变化；同时从实验开始第0、3h、6h股静脉采血行血培养、内毒素、肾功能和电解质检测。治疗结束后,继续观察食蟹猴饮食、饮水、生命体征变化。(3)统计学方法：采用SPSS21.0统计软件进行处理,计量资料用χ±s表示,多样本间均数比较采用单向方差分析及t检验,检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：实验中实验组西藏小型猪和食蟹猴经过新型生物人工肝支持系统的治疗后,各项生化指标缓慢下降,上机过程中未见血压异常、抽搐、透析综合症、发热和出血(凝血异常)等不良反应。治疗后未见发热、切口感染和出血等并发症。对照组西藏小型猪和食蟹猴的一般情况持续恶化,生化指标逐渐升高。西藏小型猪实验过程中于0h、4h、8h和食蟹猴于0h、3h、6h抽血所测得的内毒素结果均小于0.5EU/ml,血培养结果显示培养未见细菌生长。机器各项压力监测稳定,动物生命体征平稳。结论：我们成功制作出了新型生物人工肝支持系统不同治疗模式的管路,并通过相应管路测定出了不同治疗模式下的管路的预充量,检测了机器蠕动泵功能及各监测系统的稳定性,进行了密闭式水循环实验,证实了该机器的体外安全性。成功利用西藏小型猪进行了体内循环实验,验证了新型生物人工肝支持系统的体内安全性及稳定性,为该机器的有效性评估及临床试验提供了重要的经验。成功构建了西藏小型猪及食蟹猴的急性肾衰模型,并用新型生物人工肝支持系统进行治疗,进一步验证了该机器的安全性、稳定性及有效性。为下一步进行肝衰模型救治和临床试验提供了重要经验和技术支持。