背景自然杀伤细胞(natural killer, N K细胞),是一群大颗粒淋巴细胞,在抗肿瘤及感染免疫方面发挥着重大的作用。NK细胞通过其表面的活化性及抑制性受体识别靶细胞,活化性及抑制性信号的平衡决定了NK细胞介导的细胞毒作用。NK细胞对表达下调或缺失主要组织相容复合体-I(major histocompatibility complex class I, MHC-I)的靶细胞(肿瘤细胞及受感染细胞)发挥快速的自然杀伤,而不需要预先致敏。随着对NK细胞生物活性的进一步了解,以NK细胞为基础的免疫治疗在临床应用中有所发展和提高并且已经在肿瘤患者包括血液系统肿瘤中得以应用并取得了一定的疗效。根据NK细胞识别靶细胞的"missing-self"理论,异体较自体NK细胞具有更强的抗靶细胞的生物活性。NK细胞占外周淋巴细胞的5-15%。自体或异体NK细胞治疗的主要瓶颈之一是体外扩增的效率。因此,开发一个有效活化和扩增NK细胞的方法以获得足够数量和高效能的NK细胞是非常重要的。CD16属于Fcγ受体的一种类型,它是免疫球蛋白Fc段的低亲和力受体(FcyRIIIa), NK细胞上CD16与CD16激动剂即抗CD16抗体相结合能够引起NK细胞的活化而发挥NK细胞对抗肿瘤细胞的细胞毒活性并且释放细胞因子,比如干扰素γ (IFN-y)。此外,近期有研究提出通过抑制ADAM金属蛋白酶结构域17(ADAM metallopeptidase domain 17, AD AM17)阻断CD16分裂可以促进NK细胞对肿瘤的敏感性。因此,激活CD16信号通路应是一个有效的活化与扩增NK细胞的方法。通过抗体阻断免疫检查点分子途径,如程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD1)与它的配体PD-L1及PD-L2的连接而阻断抑制信号的传递在多种实体瘤及血液系统肿瘤中都取得了巨大的成功。PD1是一种细胞膜蛋白受体,与表达于抗原递呈细胞上的PD-L1/2相互作用而传递抑制性信号,这在诱导和维持外周免疫耐受的负性调控免疫应答途径中起重要的作用。T细胞在肿瘤患者的肿瘤微环境中经常被诱导性表达PD1,它与肿瘤细胞上表达的PD-L1连接,阻断T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。PD1阳性的T细胞被认为是一群“疲乏”的T细胞,特征是功能效应和扩增指数减退。除此之外,源于多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)的NK细胞也表达PD1。既然PD1分子在T细胞的发展中可以被诱导表达,那么可以推测在体外NK细胞的活化和扩增过程中PD1的表达也可能会有所提高。因此,评估NK细胞扩增体系中PD1的表达和NK细胞的功能变化与PD1阻断的联系是很有意义的。多发性骨髓瘤(MM)是一种浆细胞克隆性增生性疾病,是来源于终末分化的B淋巴细胞的血液系统恶性肿瘤,以骨质破坏和异常免疫球蛋白大量生成为特征。随着新型抗骨髓瘤药物的发展和临床应用,如蛋白酶体抑制剂硼替佐米及免疫调节剂来那度胺,MM的治疗效果已经显著提高,但是依然不能治愈。类似于其他恶性肿瘤,由于微小病灶(minimal residue disease, MRD)中的肿瘤细胞对传统化疗不敏感,肿瘤的复发难以控制。免疫治疗包括NK细胞输注联合PD1/PD-L1/2途径阻断或许能够为消除MM及其他肿瘤的MRD提供很有意义的治疗方法。目的：研究体外高效扩增正常人外周血NK细胞的方法并通过其对骨髓瘤细胞株RPMi8226细胞的杀伤进行功能检测；探讨PD1阻断对体外扩增的NK细胞对抗骨髓瘤细胞的活性及功能的影响并进行机制研究；观察NK细胞输注联合应用PD1阻断对多发性骨髓瘤小鼠皮下移植瘤生长及生存时间的影响。方法1.研究人外周血自然杀伤细胞体外高效扩增的方法并进行功能检测1.1人外周血自然杀伤细胞体外高效扩增的方法：采用淋巴细胞分离液分离正常人外周血单个核细胞,重悬于全培养液,以1×106/ml的浓度种植于孔板中,并向体系内加入CD16抗体和重组人白介素-2(IL-2)刺激NK细胞生长,37℃培养箱中孵育,定期更换培养液,添加新鲜IL-2,直至培养周期结束。1.2体外检测扩增NK细胞的活性及其对抗骨髓瘤细胞株RPMI8226的能力：在扩增第14天和21天分别收集NK细胞,台盼蓝计数并观察存活率,流式细胞术检测NK细胞纯度及活化性受体(NKp44,NKp46,NKG2D)和抑制性受体(CD158a,CD158b,NKB1)的表达。分别以慢性粒细胞白血病细胞株K562和多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226为靶细胞,CD107a易位表达检测NK细胞的脱颗粒能力,并进行PKH26和Annexin-V标记靶细胞检测NK细胞的杀伤功能。2. 体外检测PD1/PD-L1/L2途径阻断对扩增NK细胞效应功能的影响2.1体外抗体阻断PD-L1/2检测其对NK细胞细胞毒作用的影响：流式细胞术检测RPMI8226细胞上PD-L1和PD-L2的表达,确定其表达后,PMI8226与不同浓度的PD-L1和PD-L2抗体共培养2小时,作为MTT实验的靶细胞检测扩增NK细胞对其杀伤能力。2.2检测PD1在扩增NK细胞上的表达及抗体阻断PD1对NK细胞功能的影响：流式细胞术分别检测扩增第0天,14天和21天NK细胞上PD1的表达,在扩增第7天向体系中添加浓度为2.5 μg/ml的抗PD1抗体,继续培养至21天,收集NK细胞(exNK+PD1 blockage),台盼蓝计数观察存活率,流式细胞术检测NK细胞脱颗粒能力及对RPMI8226细胞的杀伤功能,观察PD1阻断对NK细胞效应的影响,并检测NK细胞上活化性受体的表达。3.体内实验检测扩增NK细胞对多发性骨髓瘤SCID小鼠的抗瘤作用3.1建立SCID鼠多发性骨髓瘤模型：准备16只6-8周龄的SCID雌性小鼠,收集对数生长期的RPMI8226细胞,将细胞以1×108cells/ml的浓度重悬于生理盐水,每只小鼠前肢背部皮下接种100μl RPMI8226细胞悬液,当肿瘤体积达到约300 mm3时开始进行治疗。3.2观察扩增NK细胞及联合PD1/PD-L1/2途径阻断抑制荷瘤小鼠骨髓瘤生长的能力：随机将16只符合条件的荷瘤小鼠分配为生理盐水(NS, control)、扩增NK细胞(exNK cells)、PD1阻断的NK细胞(exNK+PD1 blockage)以及扩增NK细胞+PD-L2抗体(exNK+PD-L2 blocking)四组。除对照组外,每组辅以腹腔注射IL-2,NK细胞经尾静脉注射,PD-L2抗体瘤内注射。观察荷瘤小鼠肿瘤体积变化及生存时间,荷瘤小鼠不能爬行时处死小鼠作为实验终止点。结果1.研究人外周血自然杀伤细胞体外高效扩增的方法并进行功能检测1.1健康供者PBMCs的NK细胞扩增：结果显示经过CD16及IL-2培养的NK细胞获得了高效扩增。扩增第21天,PBMCs扩增倍数达1002.2±394.53倍,流式细胞术检测NK细胞纯度为79.6%±3.7%,第14天和21天,NK细胞扩增倍数分别达到549.9±154.7倍和4011.5±1082.4倍。1.2扩增NK细胞的活性及其对抗骨髓瘤细胞株RPMI8226的能力增强：扩增NK细胞台盼蓝计数显示其全部存活,流式细胞术检测NK细胞活化性受体和抑制性受体的表达都明显提高,对K562和RPMI8226细胞的脱颗粒能力也分别提高至38.12%±6.16%和36.25%±7.69%,对RPMI8226细胞的杀伤能力在效靶比为0.3：1和1：1时分别提高至27.93%±3.33%和59.1%±3.6%。2. PD1/PD-L1/L2途径阻断增强了扩增NK细胞的效应功能2.1 PD-L1和PD-L2的抗体阻断加强了扩增NK细胞的细胞毒性：流式细胞术检测显示RPMI8226细胞上PD-L1和PD-L2的表达分别为58.5%±13.0%和73.1%±7.5%。RPMI8226细胞与PD-L1及PD-L2抗体共培养后作为靶细胞检测NK细胞功能,结果显示经较低浓度(1.25μg/ml)抗PD-L1抗体处理的细胞比不加抗体和较高浓度(2.5μg/m1)处理的细胞在杀伤时诱导更显著的RPMI8226细胞裂解(P<0.05)。阻断PD-L2的抗体浓度为2.5μg/ml和5.0μg/ml,相应的RPMI8226细胞的死亡率分别为31.2%±6.6%和24.1%±3.9%,但是在PD-L2的阻断实验中并没有发现剂量依赖性。2.2 PD1在扩增NK细胞上的表达升高及PD1阻断增强了扩增NK细胞对抗骨髓瘤细胞的脱颗粒及溶细胞活性：流式细胞术测定结果显示PD1很少表达于静息的NK细胞即扩增第0天的NK细胞,但是随着扩增过程的延长,PD1的表达呈逐渐上升趋势,第21天约26%的NK细胞表达PD1。在扩增体系中加入抗PD1抗体显著提高了NK细胞对RPMI8226靶细胞的脱颗粒效应,阻断PD1的NK细胞(exNK+PD1 blockage)较对照组(exNK)呈现出更高比例的CD107a阳性细胞(CD3"CD56+CD107a+,64.0%±1.0% vs.53.1%±2.7%, P<0.05)。ExNK+PD1 blockage与exNK相比更加显著地诱导RPMI8226细胞的凋亡(63.2%±6.2% vs.44.9%±7.5%, P<0.05)。为了探讨这种差异的机制,进一步检测活化性受体的表达,结果证实PD1阻断后,exNK+PD1 blockage上活化性受体NKp44、NKp46及NKG2D的表达明显高于exNK组,推测其可能为PD1阻断增强NK细胞效应的机制之一。3.扩增NK细胞体内抑制骨髓瘤细胞生长并延长荷瘤小鼠的生存时间皮下注射RPMI8226细胞,2-3周后16只小鼠的肿瘤体积都达到300mm3左右。荷瘤小鼠随机分配至为NS、exNK、exNK+PD1 blockage以及exNK+PD-L2 blocking四组,结果显示对照组小鼠的肿瘤生长速度明显快于其他三组,而exNK组和exNK+PD1 blockage组抑制肿瘤生长的效果要优于exNK+PD-L2 blocking组。治疗后的第2、3、4周,治疗组所有小鼠的肿瘤都明显小于对照组。为了检测NK细胞联合PD1/PD-L1阻断治疗的效果,我们比较了治疗后对照组第一只小鼠死亡时间点即第28天时四组肿瘤细胞的大小。结果显示exNK组、exNK-PD1 blockage组及exNK+PD-L2 blocking组的肿瘤体积要明显小于对照组,并且exNK+PD1 blockage组比exNK组表现出更有效的抑制肿瘤生长的效果,exNK+PD1 blockage组的肿瘤体积为1297.0±118.1mm3,而exNK组的肿瘤体积为2747.2±568.8mm3。我们又进一步对比了对照组与治疗组荷瘤小鼠的生存时间,结果显示对照组、exNK组、exNK+PD-L2 blocking组及exNK+PD1 blockage组的平均生存时间分别是30天、44天、49天及57天。对照组中最后一只荷瘤小鼠的死亡时间是第36天。而exNK组、exNK+PD-L2 blocking组及exNK+PD1 blockage组第一只小鼠的死亡时间分别是第35、42及47天。治疗后第53天,所有的小鼠都已死亡,三个治疗组与对照组相比都明显延长了荷瘤小鼠的生存时间。经exNK+PD1 blockage治疗的小鼠存活时间明显长于对照组(P<0.01)和exNK组(P<0.05)治疗的小鼠,而只略长于exNK+PD-L2 blockage组(P>0.05)。结论1.CD16抗体和IL-2联合应用可以高效扩增NK细胞,其纯度(>70%)和倍数(4000倍)达到理想效果,活化性受体和抑制性受体的表达上调,并且能够有效杀伤K562和RPMI8226细胞。2. RPMI8226细胞高表达PD-L1/2, PD1在NK细胞上的表达随培养周期延长而上调,体外阻断PD1-PDL1/2途径能够增强NK细胞对抗骨髓瘤细胞的脱颗粒及溶细胞能力,其机制可能与活化性受体表达升高有关。3.NK细胞及联合抗体阻断PD1/PD-L1/2途径可以有效抑制体内骨髓瘤细胞生长并延长荷瘤小鼠的生存时间。