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第一部分:新型WNT通路抑制剂LGK974放射增敏作用和机制研究目的:探讨WNT信号传导通路抑制剂LGK974在肿瘤细胞中的放疗增敏作用和机制。方法:1.通过克隆形成实验分别观察LGK974合并放疗对MLH1表达完整和MLH1表达缺失的细胞株的放疗增敏作用。2.通过克隆形成实验分别观察LGK974合并放疗对瞬时导入MLH1结肠癌细胞株HCT116(MLH1表达是缺失的)的放疗增敏作用。3.通过比较结肠癌HCT116细胞株(MLH1表达缺失)分别经对照组DMSO和实验组LGK974处理后合并放疗,用免疫荧光检测细胞中γH2AX的变化来反映LGK974通过抑制DNA损伤修复增强MLH1缺失肿瘤细胞的放疗敏感性。4.通过蛋白激酶组学Kinomic Profiling实验检测LGK974放疗增敏的可能磷酸化靶点。结果:1.LGK974在MLH1表达完整的宫颈癌HeLa细胞株中无放疗增敏作用,而在MLH1表达缺失的结直肠癌HCT116细胞株、子宫内膜癌AN3CA细胞株、卵巢癌顺铂耐药A2789/cp70细胞株中则有放疗增敏作用。2.野生型MLH1重新导入HCT116细胞株后LGK974的放疗增敏作用明显减弱。3.LGK974相对对照组DMSO而言,合并放疗后HCT116中检测到的γH2AX数目明显减少,细胞DNA损伤修复能力降低,说明LGK974有放疗增敏作用;而把MLH1导入HCT116后发现LGK974相对对照组DMSO而言,合并放疗后HCT116中检测到的γH2AX数目明显增多,细胞DNA损伤修复能力增强,LGK974放疗增敏作用减弱。4.蛋白激酶组学实验(Kinomic Profiling)发现LGK974合并放疗后PRKACα和PRKACβ磷酸化作用减弱,提示它们可能为LGK974放疗增敏的潜在靶点。结论:作为一种新型Wnt信号通路抑制剂,LGK974在MLH-1表达缺失的肿瘤中通过抑制DNA损伤修复和作用于PRKACα和PRKACβ磷酸化靶点产生放疗增敏作用。这些发现说明LGK974可能会成为一种新型的针对MLH1表达缺失肿瘤的放疗增敏剂,PRKACα和PRKACβ磷酸化靶点有可能是潜在的放疗增敏靶点。第二部分:预测头颈部鳞癌放疗敏感性MiRNA的筛选与验证目的:头颈部鳞癌中预测放疗敏感性MiRNA的筛选与验证方法:1.通过选取一对分别取自共济失调-毛细血管扩张症ATM患者(患者)及其直系亲属(正常)的人淋巴母细胞样细胞系来分析miRNA差异表达与电离放射的关系,两组分别经放疗和未放疗处理后对比进行完整的miRNA芯片实验,得到28个表达有差异的miRNA。2.在目前最大的癌症数据库TCGA数据库中通过找寻病理类型为鳞状细胞癌病例来评估这28个miRNA的临床相关性。3.利用MDA反向阶段蛋白质芯片技术检测TCGA数据库中头颈鳞癌样本中的蛋白表达水平,分别计算ATM在放射敏感和放射抗拒的患者中的平均表达水平。4.通过检测头颈鳞癌细胞系Cal27,验证放射治疗前后在抑制或不抑制ATM情况下的miRNA表达谱与最初的miRNA筛选结果及TCGA临床数据一致。5.利用STRING数据库(一个搜寻已知蛋白质之间和预测蛋白质之间相互作用的系统)(STRING9.1),对这5个可预测头颈部鳞癌放射敏感性的miRNA分子的调控目标进行通路分析(pathway analysis)。结果:共有28个miRNA在放射治疗后出现不同的差异表达,但都依赖于共济失调-毛细血管扩张症突变(Ataxia-TelangiectasiaMutated,ATM)激酶。通过验证这些miRNA最终确认有5个miRNA分子标志物可预测头颈部鳞癌放射敏感性,且这些患者中的ATM表达水平与放射敏感性相关。结论:miRNA分子标志物可用于临床预测头颈鳞癌放射治疗的敏感性。第三部分:RAS蛋白促进人脑膜瘤细胞增殖且抑制其凋亡目的:探讨RAS蛋白对人脑膜瘤细胞生长的影响。方法:将人脑膜瘤IOMM-LEE细胞分为空白对照组(细胞未进行任何药物处理)、阴性对照组(细胞经等体积生理盐水代替药物)和FTS处理组(细胞经FTS处理),采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法),FTS(75μmol/L)处理48h后采用流式细胞技术检测降低RAS活性后IOMM-LEE细胞的增殖和凋亡情况,用Western Blot检测ERK和AKT信号通路;按肾包膜下移植法建立人脑膜瘤动物模型,小鼠随机分为实验组(50mg/kg组、75mg/kg组和100mg/kg,皮下注射FTS)和对照组,免疫组化增殖细胞检测核抗原(PCNA),用Western Blot检测ERK和AKT信号通路。结果:实验发现在75 μmol/LFTS浓度下,IOMM-LEE细胞的存活率随时间的推移而明显下降(P<0.05)。75 μmol/LFTS浓度处理48h后,处理组细胞凋亡较空白组及阴性对照组均明显增加(均P<0.05);且细胞周期检测结果显示:与空白组及阴性对照组相比,处理组细胞生长阻滞在G1期,差异有统计学意义(P<0.05)。75 μmol/LFTS浓度处理48h后,相对于空白组和阴性对照组,处理组ERK和AKT的磷酸化水平显著降低(P<0.05)。体内实验结果显示:FTS处理后,与对照组和50mg/kg组相比,75mg/kg组和100mg/kg组肿瘤体积均明显减小,PCNALI均明显降低,p-ERK和p-AKT水平明显降低(均P<0.05)。结论:RAS蛋白在脑膜瘤细胞中高表达,抑制其活性可能通过下调ERK和AKT信号通路,进而调控细胞的生长。放疗疗效的本质是射线导致细胞凋亡,RAS在肿瘤放射治疗中可能是一个可调控的重要靶点。