论文部分内容阅读
目的通过体内和体外实验来研究铝的神经毒性,并且运用Caspase-3 RNA干扰来阻抑铝的神经毒性。方法1染铝双转基因小鼠体内研究：1)应用PCR技术鉴定小鼠的基因型；2)将C57BL小鼠和鉴定出的子代APP/PS1双转基因小鼠随机分为3组,即C57生理盐水组、APP/PS1生理盐水组和APP/PS1染铝组,每组8只,连续腹腔注射染铝2个月,Morris水迷宫检测实验小鼠神经行为学的变化；3)应用Annexin V-PI双染法和TUNEL法检测海马神经细胞凋亡的情况；4)运用荧光定量PCR技术检测实验动物脑组织内Caspase-3基因的表达情况。2铝神经毒性的体外研究：原代培养神经细胞,用AlCl3·6H2O染毒,分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,使其终浓度为OmM/L、0.5 mM/L、1.0 mM/L、2.0 mM/L,继续培养24h。1)光镜、荧光染色观察神经细胞的形态学变化；2)应用Cell CountingKit-8检测各组神经细胞的细胞活力：3)应用Annexin V-PI双染法检测各组神经细胞的坏死率和凋亡率。4)使用荧光定量PCR技术检测各组神经细胞内Caspase-3基因的表达情况。3 Caspase-3 RNAi在铝致神经细胞中的作用：1)订购了三个不同序列的Caspase-3 RNAi病毒试剂,通过检测细胞活力和Caspase-3基因的抑制效率,筛选出有效的Caspase-3 RNAi病毒试剂进行干预研究；2)荧光定量PCR技术检测干预后Caspase-3基因的表达情况；3)选用Caspase-3 RNAi病毒1试剂感染神经细胞,光镜、荧光染色观察神经细胞的形态学变化,Annexin V-PI双染法检测各组的坏死率和凋亡率,并检测细胞活力。结果1染铝双转基因小鼠体内研究：1)鉴定出APP/PS1双转基因小鼠；2) Morris水迷宫实验结果显示,APP/PS1生理盐水组和APP/PS1染铝组小鼠找到平台的潜伏期较对照组显著增加(P<0.01),而原平台象限的停滞时间明显缩短(P<0.01)且染铝组更为明显；3)Annexin V-PI双染法和TUNEL法结果显示,两个生理盐水组凋亡细胞较少,染铝组凋亡细胞的数目明显高于APP/PS1生理盐水组和C57BL生理盐水组(P<0.01);4荧光定量PCR结果显示,染铝组脑组织内Caspase-3基因的表达显著增高(P<0.01)。2铝神经毒性的体外研究：1)光镜下可见凋亡细胞体积缩小,随着染铝剂量的加大可以观察到神经细胞轴突和树突的数量明显减少、长度缩短,细胞间连接减少。吖啶橙(A0)-溴化乙啶(EB)双荧光染色法可以清楚地观察到细胞的早期凋亡和晚期凋亡现象,并随着染铝剂量的加大凋亡现象越发明显；2)细胞活力检测结果显示,正常对照组细胞活力较高,随着铝染毒剂量的增加,细胞活力逐渐下降,各染铝组神经细胞的活力显著低于正常对照组(P<0.01)3) Annexin V-PI双染法检测结果显示,正常对照组神经细胞凋亡较少,中、高剂量组神经细胞的凋亡率显著高于正常对照组(P<0.01)；4)荧光定量PCR结果显示,同对照组比较,中、高剂量组Caspase-3基因的表达均有统计学意义(P<0.05),且随着染铝剂量的增加Caspase-3基因的表达上调。3 Caspase-3 RNAi在铝致神经细胞凋亡中的作用研究：1)细胞活力检测结果显示,同正常活细胞组比较,染铝组细胞活力明显降低(P<0.01);同染铝组比较,三个不同序列的Caspase-3 RNAi病毒试剂组细胞活力显著增高(P<0.01)接近于正常活细胞组。荧光染色观察并计数表明Caspase-3 RNA病毒干扰试剂感染神经细胞的转染效率为91%,并且病毒1试剂抑制Caspase-3基因的抑制效率最高(66.478%)；2)荧光定量PCR结果显示,同正常活细胞组比较,1mM染铝组和1mM染铝+空病毒组细胞内Caspase-3基因的表达明显增高(P<0.01),且这两组细胞内Caspase-3基因的表达情况相近；同lmM染铝组相比较,lmM染铝+Caspase-3 RNAi病毒组细胞内Caspase-3基因表达显著降低(P<0.01),接近与正常活细胞组；3)光学显微镜观察神经细胞可见,正常活细胞组的神经细胞数量多且树突分支较多,细胞连接紧密。lmM染铝组和lmM染铝+空病毒组细胞数量明显减少,胞体皱缩,树突的数量减少,细胞连接明显减少。lmM染铝+Caspase-3 RNAi病毒组细胞从形态和数量上接近于正常活细胞组。运用吖啶橙(AO)-溴化乙锭(EB)双荧光染色法和Annexin V-PI双染法观察细胞凋亡的情况可见,正常活细胞组神经细胞呈绿色的均匀荧光,细胞凋亡率很低,lmM染铝组和lmM染铝+空病毒组神经细胞的细胞核固缩呈较浓的黄绿色,或呈半月形,甚至为黄绿色碎块,有些神经细胞的胞核染成鲜红色或桔红色,并且胞浆也染成淡红色,部分细胞结构不清或溶解,细胞凋亡率明显高于正常活细胞组(P<0.01)。lmM染铝+Caspase-3 RNAi病毒组绝大部分细胞表现为均匀绿染的活细胞,有个别细胞呈黄绿色或红色,其细胞凋亡率没有统计学意义(P>0.05),但lmM染铝组、lmM染铝+空病毒组、lmM染铝+Caspase-3 RNAi病毒组细胞的坏死率均高于正常活细胞组(P<0.01)。结论1.鉴定出APP/PS1双转基因小鼠,遗传因素APP和PS1突变基因单独作用下,能够引起小鼠学习记忆能力的下降,而遗传因素和环境因素铝的共同作用下,小鼠的学习记忆能力障碍更加明显,提示铝有可能加剧遗传因素的作用,且铝可以诱导海马神经细胞凋亡；2.铝能够诱导体外原代培养的神经细胞凋亡,且随着染铝剂量的增加,细胞活力显著下降,凋亡加重,其凋亡程度与铝的作用剂量有密切关系；3.在铝致神经细胞凋亡体内和体外研究中,染铝组细胞内Caspase-3基因表达均上调,提示Caspase-3在铝致神经细胞凋亡中起着重要的作用；4成功转染神经细胞,并且通过细胞活力的检测和Caspase-3基因抑制效率的计算可知,三个不同合成序列的Caspase-3 RNAi病毒试剂均有干预效果,其中Caspase-3 RNAi病毒1试剂的效果更加显著,选择其进行后续的干预实验研究；5用RNA干扰的方法特异性阻抑凋亡相关基因的表达可以显著提高染铝细胞的细胞活力,降低染铝细胞的凋亡率,阻抑铝诱导的细胞凋亡。