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背景:随着人口老龄化加剧,脑血管疾病尤其是缺血性脑病发病率逐渐增高。缺血性脑卒中是导致全球神经功能障碍的最大因素,造成巨大的经济和社会负担。目前临床上仍没有有效的方法治疗脑缺血再灌注(I/R)引发的继发损伤。其中,炎症反应在脑缺血再灌注中的作用至关重要。作为神经炎症中炎性细胞因子的主要来源,探索小胶质细胞/巨噬细胞极化在脑缺血再灌注中的作用机制,成为研究的热点。脑内常驻免疫细胞小胶质细胞/巨噬细胞的极化在缺血再灌注(I/R)相关的损伤和修复中发挥重要作用。静息状态的小胶质细胞/巨噬细胞在脑组织缺血缺氧损伤后激活,通过结构、表型及功能变化而活化,在神经损伤及修复中发挥双重作用,即M1型转变为M2型。M1型“促炎细胞”(表面标记主要为i NOS、CD86),产生炎症介质如IFN-β,IL-1β,倾向于诱导神经细胞损伤及死亡。M2型(表面标记主要为Arg1、CD206)又称为“修复细胞”,有利于组织修复并分泌抗炎因子如IL-10、IL-4、TGF-β等。小胶质细胞/巨噬细胞从M1向M2极化的过程具有时效性,在急性缺血缺氧损伤期,小胶质细胞/巨噬细胞表达M2信号;损伤晚期表现为M1。M2向M1型转化的过程不利于脑组织修复。干扰素调节因子5(IRF5)已被证明是免疫调节相关的关键转录因子,通过与肿瘤坏死因子相关因子(TAFR6)相互作用而被激活,介导小胶质细胞/巨噬细胞极化。因此,如何在缺血缺氧早期诱导小胶质细胞/巨噬细胞以M2型为主从而发挥抗炎及神经保护作用,成为我们研究的关注点。DJ-1(又称PARK7)是帕金森相关的常染色体隐性遗传基因,具有多种其他功能,如:活性氧ROS清除剂,蛋白分子伴侣,蛋白酶、自噬调节等。DJ-1的亚细胞定位在线粒体基质和内膜,参与线粒体生理功能,保护线粒体对抗氧化应激。DJ-1在成年大鼠脑神经系统神经元和所有神经胶质细胞的细胞质中弥漫高表达,并不受功能和解剖位置的影响。大量研究已经证实DJ-1有神经保护作用,我们前期研究报道了干扰DJ-1可以加重大鼠脑缺血再灌注损伤,增加梗死面积和神经功能损伤。DJ-1作为脑卒中有效的治疗靶点,在抗炎方面的作用受到重视。目前有研究表明DJ-1对小胶质细胞/巨噬细胞极化有调控作用。但DJ-1是否参与小胶质细胞/巨噬细胞极化在脑I/R中起神经保护作用,其具体机制尚未可知。目的:探讨DJ-1调控脑缺血再灌注损伤中小胶质细胞/巨噬细胞极化及其可能机制。方法:本研究以成年雄性SD大鼠和大鼠永生化小胶质细胞HAPI细胞系为研究对象,分别采用大脑中动脉闭塞/再灌注(Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion,MCAO/R)和氧葡萄糖剥夺/复糖复氧(Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation,OGD/R)模型模拟在体和离体大脑缺血再灌注损伤。第一部分(1)用激光多谱勒脑血流仪检测大鼠MCAO/R过程中大脑中动脉脑血流变化。(2)通过建立不同时间点的MCAO/R模型,大鼠大脑中动脉分别栓塞10min、30min、1h,再灌注24h,用TTC染色实验观察大鼠脑梗死体积。(3)在MCAO/R模型建立前24h,经侧脑室注射三种不同序列的DJ-1si RNA干扰片段和不同浓度的基于DJ-1的多肽ND13,Western blot实验观察不同序列DJ-1siRNA的干扰效率以及不同浓度ND13对小胶质细胞/巨噬细胞标记物Arg1、i NOS表达水平的影响。(4)通过建立不同时间点的OGD/R模型,HAPI细胞分别缺糖缺氧1h、2h、4h、6h后复糖复氧24h,CCK-8实验检测小胶质细胞/巨噬细胞增殖指数。(5)在建立OGD/R模型前24h,HAPI细胞与不同浓度ND13(0μM、5μM、10μM、15μM、20μM)。共培养,CCK-8实验检测小胶质细胞/巨噬细胞增殖指数。第二部分(1)建立DJ-1siRNA或ND13处理的大鼠MCAO/R模型。(2)用Western blot实验检测DJ-1si RNA或ND13处理后对小胶质细胞/巨噬细胞标记物Arg1、CD163、i NOS和CD86表达水平的影响。(3)用Western blot实验检测DJ-1si RNA或ND13处理后对炎症因子IL-10、IL-4、TNF-α和IL-1β表达水平的影响。第三部分(1)用Western blot实验检测DJ-1si RNA或ND13处理对P62蛋白水平的影响;免疫共沉淀(Co-IP)实验检测ND13处理后对P62与TRAF6相互作用的影响。(2)用Western blot实验检测DJ-1siRNA或ND13处理后对通路蛋白TRAF6、IRF5、IKKαβ表达水平的影响。(3)经侧脑室同时注射ND13和P62特异性抑制剂XRK3F2后24h,建立大鼠MCAO/R模型。(4)观察ND13和XRK3F2联合应用对大鼠MCAO/R神经功能损伤、脑梗死体积、脑组织细胞形态的影响。第四部分(1)用Western blot实验检测MCAO/R模型和OGD/R模型中ND13和XRK3F2共同作用对小胶质细胞/巨噬细胞标记物Arg1、CD163、iNOS和CD86表达水平的影响;对炎症因子IL-10、IL-4、TNF-α和IL-1β表达水平的影响。(2)用免疫共沉淀(Co-IP)实验检测MCAO/R模型和OGD/R模型中ND13和XRK3F2共同作用对P62与TRAF6相互作用的影响;用Western blot实验检测MCAO/R模型和OGD/R模型中ND13和XRK3F2共同作用对通路蛋白P62、TRAF6、IRF5、IKKαβ表达水平的影响。在OGD/R模型中用免疫荧光双标实验观察ND13和XRK3F2共同作用IRF5定位以及入核情况。结果:第一部分(1)大鼠大脑中动脉血流下降率大于70%则MCAO模型建立成功。(2)MCAO1h/R24h时大鼠神经功能学评分和脑梗死体积显著高于sham组、10min、30min组。(3)在大鼠MCAO/R模型中DJ-1siRNA干扰片段(sense5’-3’CCCAUUGGCUAAGGACAAATT,antisense5’-3’UUUGUCCUUAGCCAAUGGGTT)的干扰效率最明显。大鼠MCAO/R模型中ND13浓度为0.2μg/μl时显著上调Arg1的表达水平。(4)OGD4h/24h时HAPI细胞存活率约为48.63%。(5)HAPI细胞OGD/R模型中ND13浓度为15μM时HAPI细胞增殖能力显著高于其他浓度组。第二部分(1)DJ-1siRNA干扰DJ-1的表达后,小胶质细胞/巨噬细胞M1型标记蛋白(iNOS和CD86)水平增高;ND13处理后小胶质细胞/巨噬细胞M2型标记蛋白(Arg1和CD163)水平增高。(2)DJ-1si RNA干扰DJ-1的表达后促炎性炎症因子(TNF-α和IL-1β)表达升高;ND13处理后抗炎性炎症因子(IL-10和IL-4)表达升高。第三部分(1)DJ-1siRNA干扰DJ-1的表达后P62蛋白水平升高,ND13处理后P62蛋白水平下降。ND13处理后,P62与TRAF6相互作用减弱。(2)DJ-1siRNA干扰DJ-1的表达后TRAF6、IRF5表达水平增高;ND13处理后TRAF6、IRF5表达水平下降。但DJ-1 siRNA干扰后IKKαβ水平降低,ND13处理后上调。(3)与单独使用ND13相比,同时使用ND13和P62抑制剂XRK3F2大鼠神经功能学评分降低、脑梗死体积减少,神经细胞缺血性损伤缓解。第四部分(1)在MCAO/R和OGD/R模型中,与单独使用ND13相比,ND13与XRK3F2联合处理时小胶质细胞/巨噬细胞M2型标记蛋白水平进一步增高,抗炎性炎症因子表达进一步升高。(2)在MCAO/R和OGD/R模型中,与单独使用ND13相比,ND13与XRK3F2联合应用后P62与TRAF6相互作用进一步减弱;同时P62、TRAF6、IRF5表达水平进一步下降;但是ND13与XRK3F2联合应用后IKKαβ表达明显低于ND13组。(3)在OGD/R模型中,IRF5表达在细胞质中,少量表达于线粒体。OGD/R后,IRF5与细胞核共定位信号增强;ND13增强DJ-1活性降低了IRF5的表达。经ND13与XRK3F2共同处理后,IRF5核阳性细胞数量较ND13组下降。结论:DJ-1调节小胶质细胞/巨噬细胞极化和炎症因子分泌,减轻脑缺血再灌注炎性损伤。DJ-1抑制P62的表达,影响P62与TRAF6的相互作用。DJ-1通过P62介导的TRAF6/IRF5信号通路调节小胶质细胞/巨噬细胞极化,可能成为缺血性脑卒中潜在的治疗靶点。