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目的1.探讨血红素加氧酶-1与慢性髓系白血病疾病进展及复发的相关性及预示作用;2.体内、外探讨靶向沉默HO-1基因对人M2型急性髓系白血病细胞增殖与凋亡的影响;3.探讨沉默HO-1促进Kasumi-1细胞凋亡的可能机制。方法1.纳入25例CML患者和21例正常供者为研究对象,采集各临床状态(慢性期、加速期、急变期、获得主要分子生物学缓解和复发)的骨髓和外周血样本各60份,以及正常供者骨髓和外周血各21份。Real-time PCR SYBR Green法检测患者及正常供者外周血HO-1mRNA表达;Taqman探针法检测患者骨髓血中bcr/abl表达;血常规监测患者外周血白细胞及血小板计数;流式细胞术检测患者骨髓原始细胞比例;ROC曲线分析HO-1 mRNA对CML疾病分期的诊断能力;数据进行Wilcoxon检验和方差分析、相关线性回归分析。2.针对AML-M2细胞的体外研究中,RT-PCR检测M2型白血病骨髓单个核细胞中HO-1 mRNA表达;利用重组人HO-1小干扰RNA的重组慢病毒(pRNAi-siHO-1-GFP),感染人M2型白血病骨髓单个核细胞,同时设转空载体对照和空白对照,荧光显微镜观察感染效率。系列浓度的柔红霉素处理骨髓单个核细胞后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Real-time PCR和Western blot检测HO-1及凋亡相关基因Caspase3、Caspase8、Caspase9mRNA及蛋白表达水平。体内研究利用AML1/ETO阳性的Kasumi-1细胞建立AML-M2细胞裸鼠移植瘤模型,观察裸鼠成瘤情况,绘制生存曲线,定期监测各组裸鼠血常规变化,Real-time PCR检测成瘤裸鼠骨髓、肝、脾、肾脏及肺中融合基因AML1-ETO的表达,制作病理切片以观察炎性细胞对各脏器的浸润情况。3.重组人HO-1小干扰RNA慢病毒转染Kasumi-1细胞,荧光显微镜及流式细胞术观察病毒感染效率;柔红霉素作用后,MTT检测细胞增殖抑制率;Annexin-V-7-AAD双染色检测细胞凋亡率;DCFH-DA探针法检测活性氧生成;Fluo3-AM探针法分析胞内钙离子积累情况;JC-1探针法检测线粒体膜电位改变。Real-time PCR和Western Blot检测HO-1及凋亡相关蛋白 Caspase12、8、9,Cleaved-caspase3,Cleaved-PARP 及胞浆Cytochrome C mRNA和蛋白水平的表达;用ROS清除剂或(和)Ca2+螯合剂作用后检测相关凋亡蛋白表达、细胞凋亡率、Ca2+积累以及ROS生成变化,观察影响细胞凋亡效应和探讨其可能涉及的凋亡通路。结果1.HO-1 mRNA在CML患者外周血中相对表达为0.5710 ± 3.778,显著高于正常供者的1.417E-06 ±1.125E-06;按缓解和复发分组,连续监测从CML疾病状态到获得完全分子生物学缓解的5例样本,HO-1 mRNA相对表达由0.0615 ±0.0624下降到0.0094 ±0.0067,而在获得完全分子生物学缓解后复发的8例样本中HO-1 mRNA相对表达由0.0206 ± 0.0210升高至3.852 ± 10.285;获得完全分子生物学缓解后,HO-1 mRNA在患者外周血中的相对表达为0.0163 ±0.0175,仍显著高于正常供者;按CML疾病分期进行分组,患者外周血HO-1 mRNA在慢性期、加速期及急变期相对表达随疾病分期进展而表达升高,分别为0.0095±0.0176,0.0280±0.0557和0.2767 土 0.44,组间差异具统计学意义;动态监测发现CML疾病状态反复伴随外周血HO-1表达波动,而bcr/abl表达量与疾病分期无显著相关。HO-1相对表达和CML患者原始细胞计数呈一定的线性相关,r=0.584。ROC分析结果显示,HO-1相对表达对CML诊断(或CML慢性期诊断)的AUC值为1,准确度达100%,对加速期及急变期诊断AUC分别为0.748和0.965。HO-1相对表达对CML慢性期、加速期及急变期的诊断临界值分别为0.000070,0.001917和0.020696。2.荧光显微镜观察发现GFP在慢病毒转染72h后表达最高,绿色荧光最亮;在转染pRNAi-siHO-1-GFP后,HO-1mRNA及蛋白表达水平均显著下调;各组BMMNC的增殖抑制率对柔红霉素作用呈时间剂量依赖关系,且pRNAi-siHO-1-BMMNC组细胞存活受到显著抑制,相应时间点的细胞凋亡率亦高于空载体组和空白对照组;同时,该组中HO-1mRNA和蛋白表达均下调,而Caspase3,Caspase8和Caspase9的mRNA及蛋白水平上调。体内试验中,成功构建Kasumi-1细胞移植瘤裸鼠模型,在注射Kasumi-1细胞和转染pRNAi-siHO-1-GFP的Kasumi-1细胞的裸鼠成瘤率达100%。Kasumi组注射后第6天成瘤,早于pRNAi-siHO-1-Kasumi组的第10天,瘤体增长迅速且体积较大;尾静脉取血监测血常规提示Kasumi组裸鼠白细胞、血红蛋白及血小板计数较pRNAi-siHO-1-Kasumi 组减少。K-M 生存曲线显示 pRNAi-siHO 1-Kasumi 组成瘤后存活时间长于Kasumi组。成瘤裸鼠骨髓、肝脏和脾脏中AML1-ETO融合基因表达明显高于肾脏和肺,且在Kasumi组相应脏器中的表达显著高于pRNAi-siHO-1-Kasumi组。HE染色可观察到Kasumi组各脏器均有较多的炎性细胞浸润,尤其肝脏及脾脏较为明显,而肺和肾脏炎性细胞浸润程度较轻;而pRNAi-siHO-1-Kasumi组中炎症细胞对各脏器的浸润程度较Kasumi-1组轻。3.荧光显微镜及流式细胞术检测显示慢病毒载体pRNAi-siHO-1-GFP成功转染Kasumi-1细胞;转染pRNAi-siHO-1-GFP慢病毒的Kasumi-1细胞中HO-1表达受到有效沉默;柔红霉素对Kasumi-1细胞增殖抑制率的影响呈时间剂量依赖关系,柔红霉素和pRNAi-siHO-1-GFP联合作用可显著抑制Kasumi-1细胞增殖、增加细胞凋亡。转染pRNAi-siHO-1-GFP的Kasumi-1细胞中,内质网凋亡特异蛋白Caspase12激活,Ca2+积累增加,ROS生成增加,MTP降低,Cyto C从线粒体释放,胞浆Cyto C表达增加,Cleaved-capsase3及其底物Cleaved-PARP表达增加。NAC或(和)BAPTA-AM的单独(联合)处理后,Kasumi-1细胞中Caspase12、胞浆CytoC的表达降低,Ca2+积累和ROS生成减少,凋亡率降低。结论1.研究提示CML患者外周血中HO-1呈高表达;其表达与疾病分期、进展和复发高度相关,表达下降可能提示分子生物学缓解,而表达升高可能说明疾病进展或复发风险;ROC曲线分析证实,HO-1可能成为提示CML疾病进展和复发风险的一个新指标。2.体内外研究结果表明,慢病毒介导的HO-1基因沉默可能通过caspase依赖的凋亡通路促进人AML-M2细胞凋亡、抑制细胞增殖。靶向沉默HO-1表达,可抑制Kasumi-1细胞在裸鼠体内增殖,减轻炎性细胞浸润,延长裸鼠存活时间,该研究为AML-M2分子靶向治疗研究提供了一定实验依据。3.HO-1 siRNA一方面可能通过破坏内质网稳态,释放Ca2+同时激活Caspase12进一步激活内质网凋亡通路;另一方面,可能通过破坏细胞氧化还原系统稳态,使ROS生成增加,MTP降低,进而释放CytoC,募集Caspase9,激活Caspase级联反应从而激活线粒体凋亡途径。这两条凋亡途径最后可通过Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP执行细胞凋亡功能,且在参与HO-1 siRNA促使Kasumi-1细胞凋亡的生物事件中,这两条凋亡通路可能存在Ca2+-ROS的相互依赖、交互作用。