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缺血性心脏病是危害人类健康的重要疾病。早期血运重建是目前治疗缺血性心脏病最有效的治疗手段,但是血运重建常伴发心肌缺血/再灌注损伤,后者常导致心肌顿抑、心律失常及细胞死亡,因此深入探讨缺血再灌注损伤的机制对保护心肌有重要的价值。治疗性低温能显著缩小缺血再灌注损伤所致梗死面积,寻找降低体温药物有望为急性心肌梗死的心肌保护提供更有效方法。目的:1.研究降低体温药物3-碘甲状腺原氨酸（3-Iodothyronamine,T1AM）在心肌缺血再灌注损伤中的作用;2.探索T1AM是否通过Akt/Fox O1信号通路减少心肌缺血再灌注损伤;3.探讨T1AM是否通过调控Akt/Fox O1信号通路抑制心肌细胞代谢从而减少心肌细胞凋亡,寻找防治缺血再灌注有效的手段。方法:1.在体内,腹腔注射T1AM及溶剂对照,记录正常大鼠肛温变化情况;建立大鼠心肌缺血再灌注模型,给予冠状动脉左前降支缺血30 min,再灌注3 h。所有动物随机分为三组:（1）假手术组:只开胸,不结扎线;（2）模型组:造模前腹腔注射给予对照溶剂后再将冠状动脉左前降支缺血30 min,再灌注3 h;（3）给药组:造模前腹腔注射给予T1AM后再将冠状动脉左前降支缺血30 min,再灌注3 h。利用心电图检测各组不同时间点大鼠ECG变化;利用心脏超声检测各组大鼠心脏左室壁活动度及其射血分数;利用TTC染色观察大鼠心肌梗死面积;利用透射电镜观察大鼠心肌细胞线粒体变化;利用血清标本检测其CK,CK-MB及LDH变化;利用Western Blot观察各组Fox O1,Akt,p-Fox O1,PPARα,Glut1,Bcl-2及其Bax表达的变化。2.体外传代培养AC-16细胞,细胞实验分为四组（1）AC-16组:细胞常氧条件下培养,给予对照溶剂处理;（2）T1AM组:细胞常氧条件下培养,给予2μM T1AM处理AC-16细胞;（3）H/R组:给予对照溶剂处理后心肌细胞缺氧24 h,复氧4 h;（4）H/R+T1AM组:给予2μM T1AM处理后心肌细胞缺氧24 h,复氧4 h。利用RNA-Seq观察各组细胞之间差异表达基因;利用韦恩图分析共同的差异基因;利用KEGG分析差异表达基因主要涉及的信号通路;利用RT-q PCR法验证差异基因的表达的可靠性。3.体外传代培养AC-16细胞,细胞实验分为七组（1）AC-16组:细胞常氧条件下培养,给予对照溶剂处理;（2）T1AM组:细胞常氧条件下培养,给予2μM T1AM处理AC-16细胞;（3）H/R组:给予对照溶剂处理后,心肌细胞缺氧24 h,复氧4 h;（4）H/R+0.5μM T1AM组:给予0.5μM T1AM处理后,心肌细胞缺氧24 h,复氧4h。（5）H/R+2μM T1AM组:给予2μM T1AM处理后,心肌细胞缺氧24 h,复氧4 h。（6）H/R+5μM T1AM组:给予5μM T1AM处理后,心肌细胞缺氧24 h,复氧4 h。（7）H/R+2μM T1AM+30 n M AS1842856组:给予2μM T1AM和30 n M AS1842856处理后,心肌细胞缺氧24 h,复氧4 h。利用倒置显微镜观察各组细胞形态变化;利用葡萄糖摄取比色法测定各组细胞细胞葡萄糖摄取;利用乳酸比色法测定各组细胞乳酸生成;利用Annexin V-PI检测各组细胞凋亡及坏死的比例;Western Blot法检测各组细胞内Akt,Fox O1,p-Fox O1,PPARα,Gck,Glut1,Bax及Bcl-2蛋白水平的表达;q RT-PCR法检测各组细胞内Akt,Fox O1,PPARα,Gck分子水平的表达。结果:1.在体内,给予正常大鼠T1AM后,大鼠体温迅速下降,最低可降至32.68+1.08℃（P<0.01）;较假手术组比较,缺血再灌注模型组心脏超声显示大鼠心室壁活动减弱,EF值为明显降低（P<0.001）,TTC染色显示心肌缺血面积明显增大,透射电镜结果提示线粒体内外膜间隙较大,线粒体肿胀,心肌酶学结果提示,血清中CK,CK-MB及其LDH明显升高（P<0.001）;与心肌缺血再灌注组相比,T1AM组心脏超声显示大鼠心室壁活动增强,射血分数和左室短轴收缩率明显增加（P<0.001,P<0.005）,TTC染色显示心肌缺血面积明显缩小,透射电镜结果提示线粒体肿胀程度明显减弱,心肌酶谱检测结果提示血清中CK,CK-MB及LDH明显降低;Western Blot结果提示,较假手术组比较,缺血再灌注组Fox O1,PPARα,Bcl-2表达明显下降,p-Fox O1,Bax及其Glut1表达明显增加;较缺血再灌注组比较,T1AM组Fox O1,PPARα,Bcl-2明显上调,Akt,p-Fox O1,Bax及其Glut1表达明显下降。2.在细胞水平,CCK-8测定细胞活性,相对于正常对照组,缺氧24 h复氧4 h后细胞活性为62.47%+3.49%（P<0.001）;T1AM对缺氧/复氧心肌细胞的保护浓度呈钟型对称,低浓度T1AM可以明显提高缺氧/复氧心肌细胞存活率,但随着T1AM浓度（20μM,60μM）继续增加,T1AM对心肌细胞AC-16产生毒性,细胞存活率逐渐降低。因此,后续实验采用低浓度T1AM作用于心肌细胞,缺氧/复氧模型采用细胞缺氧24 h,复氧4 h方案进行。RNA-Seq分析四组之间差异表达基因结果提示,相对于缺氧/复氧组,缺氧/复氧药物处理后,表达上调基因有142个,下调基因有68个;相对于正常对照组,T1AM组表达上调的基因有89个,下调的基因仅有9个;相对于正常对照组,缺氧/复氧组表达上调基因有1215个,下调的基因有452个。通过韦恩图进行分析,H/R vs.AC-16的差异基因和T1AM+H/R vs.H/R的差异基因,有135个基因重叠出现,这些基因经KEGG通路分析提示,差异表达基因主要富集到HIF-1信号通路,Fox O信号通路,p53信号通路,氨基酸合成信号通路,花生四烯酸代谢,α亚麻酸代谢信号通路,蛋白消化及吸收等信号通路上。GO分析结果提示,共同差异基因表达主要富集在细胞代谢过程等生物过程中。通过q RT-PCR验证,结果提示,q RT-PCR结果与RNA-Seq结果一致,确保RNA-Seq结果的可靠性。3.在细胞水平,通过CCK-8检测发现,T1AM作用于正常AC-16细胞24 h,药物IC50为62μM;通过倒置显微镜下观察AC-16细胞的生长情况,AC-16组细胞之间连接紧密,核仁清晰可见,H/R组可见细胞死亡增多,失去固有形态,2μM T1AM可使缺氧/复氧心肌细胞恢复细胞间的紧密连接及其细胞固有的形态;通过细胞能量代谢实时测定发现,与AC-16组比较,随着T1AM浓度增加,线粒体呼吸曲线明显降低,但在加入Fox O1抑制剂（30 n M AS1842856）,该呼吸曲线的降低效应可以被恢复;通过葡萄糖比色法及乳酸比色法发现,与常氧组进行对比,缺氧/复氧可以引起AC-16细胞葡萄糖摄取明显增加（P<0.005）,乳酸生成明显增加（P<0.01）,与缺氧/复氧组对比,随T1AM浓度增加,AC-16细胞摄取葡萄糖逐渐减少,乳酸生成亦逐渐减少,与2μM T1AM+H/R组对比,30 n M AS1842856（Fox O1抑制剂）可明显逆转T1AM减少AC-16细胞摄取葡萄糖的现象及乳酸生成的现象（P<0.01）;通过Annexin V/PI染色发现,与正常对照相比,缺氧/复氧组细胞凋亡比例明显增加（P<0.01）,加入低浓度T1AM,使得细胞凋亡比例明显减少（2μM T1AM:P<0.01;5μM T1AM:P<0.005）,加入Fox O1抑制剂（30n M AS1842856）,细胞的凋亡比例又明显增加,该现象可以被恢复（P<0.005）;在蛋白水平上,随着T1AM浓度增加,细胞内Akt1,p-Fox O1,Glut1,Bax表达量明显减少,Fox O1,PPARα,Bcl-2表达明显增加,但应用Fox O1抑制剂AS1842856后,Akt的表达无明显变化（P>0.05）,p-Fox O1,Bax,Glut1的表达明显增加,Fox O1,PPARα及Bcl-2的表达明显降低,Fox O1抑制剂可以明显回复p-Fox O1,Fox O1,Glut1,Bcl-2,Bax及其PPARα的表达,但无论是T1AM还是Fox O1抑制剂对Gck的表达都无明显差异（P>0.05）。在分子水平上,随着T1AM浓度增加,细胞内Akt1表达量明显减少,细胞内Fox O1,PPARα表达明显增加,应用Fox O1抑制剂AS1842856后,Akt的表达无明显变化（P>0.05）,Fox O1及PPARα的表达明显降低（P<0.01）。结论:1.T1AM可以减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,保护心肌细胞。2.与常氧组比较,缺氧/复氧损伤对心肌细胞差异基因显著,T1AM可以通过代谢相关通路减少心肌细胞（AC-16细胞）缺氧/复氧损伤。3.T1AM可通过调控Akt/Fox O1信号通路降低心肌细胞代谢从而减少细胞凋亡。