【摘 要】
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辣椒(Capsicum annuum L.)是一种重要的蔬菜作物,但由于病害特别是真菌性病害较为严重,对辣椒产量和品质的影响较大,因此,提高抗病性是辣椒育种的目标之一。利用遗传转化
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辣椒(Capsicum annuum L.)是一种重要的蔬菜作物,但由于病害特别是真菌性病害较为严重,对辣椒产量和品质的影响较大,因此,提高抗病性是辣椒育种的目标之一。利用遗传转化技术将外源抗病基因导入辣椒是辣椒抗病育种的新途径。 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶是两类与抗真菌有关的蛋白,它们能水解真菌细胞壁的两种主要成分——几丁质和葡聚糖,目前已被广泛用于植物抗真菌病基因工程中。本研究旨在将木霉几丁质酶和烟草β-1,3-葡聚糖酶基因导入辣椒,以提高辣椒抗病性。 辣椒离体再生困难、遗传转化率低是制约辣椒基因工程发展的最大障碍。要将外源基因导入辣椒,首先必须建立高效的辣椒离体再生体系和稳定的遗传转化体系。本研究以9 个辣椒栽培种为实验材料,较系统的分析了培养基成份、辣椒材料基因型、外植体生理状态等因素对子叶和下胚轴离体再生的影响,建立起有效的辣椒离体再生体系;以此再生体系为基础,通过对农杆菌转化条件的优化,从而建立起稳定的辣椒遗传转化体系;在这两种体系的基础上,利用农杆菌介导的转化方法,将抗真菌病基因——木霉几丁质酶基因和烟草β-1,3-葡聚糖酶基因成功的导入辣椒基因组中。 本研究取得的主要结果如下: 1.辣椒不同外植体的再生能力有差别,子叶的再生能力高于下胚轴;不同基 因型其外植体再生能力也不同; 2.通过不同激素配比对辣椒离体再生效果的研究,筛选出了辣椒离体再生的3 个较好的培养基配方:芽分化培养基--MB5+5mg/L6-BA+0.5mg/LIAA+4 mg/LAgNO3 +30g/L 蔗糖+5g/L 琼脂(子叶),MB5+3mg/L6-BA+1mg/LIAA+4mg/LAgNO3+30g/L 蔗糖+5g/L 琼脂(下胚轴),芽伸长培养基--MB5+3mg/L6-BA+1mg/LIAA+2mg/LGA3+4 mg /LAgNO3+30g/L 蔗糖+5g/L 琼脂,生根培养基--1/2MS+0.2IAAmg/L+0.1mg/LNAA; 4mg/LAgNO3能很好地控制外植体褐化,并明显促进外植体的分化;不定芽在附加B5维生素的培养基上长势好于在MS培养基上。 3.外植体芽分化及生根阶段分别以50mg/L和25mg/L的Km浓度为选择压,子叶和下胚轴在芽伸长阶分别加入25mg/L和50mg/L的Km进行选择;农杆菌侵染的适宜时间是5～8min;预培养、共培养、延迟选择培养的最佳时间为2d;500mg/L的羧苄青霉素可有效抑制农杆菌的生长;根诱导阶段以200mg/L头孢霉素代替羧苄青霉素有利于根的诱导; 4.建立起了辣椒下胚轴稳定的遗传转化再生体系,筛选出具有较高转化效率的辣椒基因型品种;以下胚轴为转化受体材料,通过浓杆菌介导法将Chi和Glu基因导入辣椒,经PCR检测,获得了30株阳性转基因植株。
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