牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）属于黄病毒科、瘟病毒属,单股正链RNA病毒。NS5A是一种具有亲水活性的病毒非结构蛋白,黄病毒科各成员中的NS5A通过丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化,其在病毒生命周期具有一定的作用。据报道黄热病毒、丙型肝炎病毒等黄病毒科病毒基因组多个位点存在m6A甲基化修饰现象,NS3和NS5区域内富集了m6A位点,潜在保守的m6A位点可以调节病毒的成熟过程。研究表明m6A可机械调节丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）颗粒的产生,敲低m6A甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase like 3,METTL3）、甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like 14,METTL14）后显著增加了HCV NS5A蛋白的丰度;相反,敲低m6A去甲基化酶肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein,FTO）后,NS5A蛋白表达明显降低。由于BVDV NS5A与HCV NS5A的结构和功能极为相似,推测m6A也可调控BVDV NS5A蛋白的表达水平,进而影响病毒颗粒的产生。本研究探讨了BVDV复制对m6A甲基化修饰的影响以及BVDV NS5A蛋白与m6A甲基化蛋白的关系,为深入了解m6A甲基化修饰调控病毒复制的分子机制奠定基础。首先,为了确定感染BVDV后MDBK细胞中的m6A甲基化水平变化,在病毒感染细胞后用q-PCR和Western-blot检测了甲基转移酶METTL3、METTL14和去甲基化酶FTO的转录和表达水平,以及甲基化结合蛋白YTH结构域蛋白YTHDF1（YTH domain-containing family protein 1）,YTHDF2（YTH domain-containing family protein2）,YTHDC1（YTH domain-containing protein1）的转录水平。结果显示,CP和NCP型BVDV感染后METTL3的转录和蛋白表达水平均下降,FTO的转录和蛋白表达水平均升高,YTHDF1转录水平下降,YTHDF2、YTHDC1转录水平均升高。研究表明CP和NCP型BVDV感染影响m6A甲基化蛋白的表达。其次,通过PCR扩增、胶回收、双酶切鉴定目的基因及表达载体、连接与转化等方法,构建了pcDA3.0-METTL3、pcDA3.0-METTL14、pcDA3.0-FTO真核表达质粒。将上述鉴定正确重组质粒通过磷酸钙法转染至293T细胞中,进行Western blot验证。结果显示,在64KDa、52KDa、58KDa处出现明显的目的条带,与预期大小一致。研究表明成功构建了牛METTL3、METTL14、FTO蛋白真核表达载体,并对牛METTL3和FTO蛋白进行生物信息学分析,对为后续研究奠定了基础。第三,利用生物信息学软件预测了牛METTL3蛋白与NS5A蛋白的互作,并利用Co-IP等方法验证其互作关系。预测结果表明牛METTL3蛋白与NS5A蛋白具备互作的可能性。将NS5A与METTL3质粒共转染至293T细胞中,通过Co-IP方法进行正反向互作分析。结果显示,METTL3蛋白与BVDV NS5A蛋白发生共沉淀;初步证明BVDV NS5A蛋白与甲基转移酶METTL3存在相互作用。在293T细胞中,过表达甲基转移酶METTL3蛋白能使BVDV NS5A蛋白表达量降低,过表达去甲基化酶FTO蛋白能使BVDV NS5A蛋白表达量升高,过表达BVDV NS5A蛋白能使甲基转移酶METTL3蛋白表达量降低,并使去甲基化酶FTO蛋白表达量升高。在MDBK细胞中,过表达甲基转移酶METTL3,能抑制病毒的复制。综上所述,本研究证明了CP和NCP型BVDV感染MDBK细胞后能够影响m6A甲基化蛋白表达水平;BVDV NS5A蛋白与甲基转移酶METTL3有相互作用,在293T细胞中过表达METTL3能使NS5A蛋白的表达量降低,过表达FTO能使NS5A蛋白的表达量升高。而过表达BVDV NS5A蛋白能是使METTL3的表达表达量降低,FTO的表达量升高。在MDBK细胞中,过表达甲基转移酶METTL3,能抑制病毒的复制。本研究为深入了解BVDV NS5A蛋白的功能及m6A甲基化修饰调控病毒复制的分子机制奠定了基础。