目的:肿瘤干细胞(Cancer stem cells)是肿瘤细胞中一小部分具有干细胞特性的细胞,具有自我更新、无限增殖的能力,在癌症的发生、发展、迁移及耐药性等方面起到至关重要的作用,因此肿瘤细胞的干性研究具有重要的意义和价值,是药物防治肿瘤的新策略和新方向。本研究通过微井阵列来培养肿瘤球,达到筛选和富集肿瘤干细胞的目的,解决肿瘤干细胞研究过程中干细胞来源问题。利用肿瘤球/单细胞筛分芯片,结合荧光显微技术和实时荧光定量PCR技术,建立判断肿瘤干细胞存活率、单个肿瘤细胞基因表达和单细胞全基因组扩增的方法。利用这一技术,在单细胞水平上观察基因表达动态变化情况,及表观遗传学相关药物RG108和丁酸钠对基因表达的影响。本课题旨在建立基于单个肿瘤干细胞药物筛选模型和评价方法,为未来微流控芯片技术实现高通量肿瘤干细胞药物筛选作前期准备。方法:首先,建立微阵列结构平台,并对微阵列结构性能评估,包括单个细胞捕获效率、与常规96孔板培养比较、利用微井阵列培养肿瘤球活性评估以及实现单个细胞成球的验证。其次,对单个细胞形成的肿瘤球球内干性基因表达进行检测,包括建立肿瘤球/单细胞筛分芯片平台、单细胞RT体系优化以及检测A549细胞干性培养6day后,干性基因表达情况。接着,在单细胞水平上观察干性条件培养0、6、14 day,干性基因表达的动态变化,在这个基础上,观察丁酸钠、RG108对A549细胞的作用;最后,在转录水平上观察干性相关基因的表达,通过全转录组扩增的方法,对3个细胞为一组的c DNA进行扩增,并对相关干性基因进行检测。结果:结果表明,在微井阵列中,A549细胞有良好的分散性,在不同细胞密度下,微井对细胞捕获效果不一样,细胞密度在24000和60000个/孔时,单个微井中捕获两个或两个以上的细胞较多,细胞密度在12000个/孔的密度时,单细胞捕获效率为55%。与常规96孔板比较,利用微井阵列培养肿瘤球细胞的增殖能力更强。14 day的干性培养后,肿瘤球活性良好,肿瘤球中98%的细胞都是活细胞。此外,通过控制细胞密度为1000和2000个/孔时,可以实现单个细胞培养成肿瘤球。通过制备肿瘤球/单细胞筛分芯片,可以分选出单个肿瘤球和单个细胞。对单个细胞的RT反应体系的优化,发现5μl的RT反应体系为最佳的体系。单细胞水平上检测干性培养6 day的单个肿瘤球内单个细胞中c-Myc,Nanog,Sox2和Oct4四个基因的表达,发现来自同一个肿瘤球的单细胞,基因表达情况也不一样,在总体分布上,c-Myc和Nanog是双尾分布,Oct4和Sox2是零星分布。A549细胞干性培养后,c-Myc、Nanog和Oct4表达是随着时间增加而增加,但是Sox2的变化不明显;在分布上,干性培养0、6、14 day后,c-Myc和Nanog都呈双尾分布,Oct4和Sox2都呈零星分布;使用RG108和丁酸钠,除了Sox2基因变化不大,其他三个基因的表达都有所下降,基因表达分布与干性培养14 day趋势一致。利用全扩增技术,细胞数3个为一组时,扩增效果稳定。通过全扩增技术检测干性培养14 day后细胞内基因的表达,其中Serpine2,Tle1,Gabrb3,Cd9,Klf4,Brix1这6个基因的表达水平明显增加,其他基因变化不明显。结论:通过微井阵列,可以富集大量肿瘤干细胞,解决肿瘤干细胞来源问题;通过肿瘤球/单细胞筛分芯片,可以建立基于少量细胞基因检测的方法;通过全转录组扩增,可以增加样品数量,检测更多基因。