论文部分内容阅读
目的:探讨低频低功率超声诱导大鼠C6胶质瘤细胞(简称:C6细胞,下同)凋亡,及其在诱导胶质瘤细胞凋亡中的作用机制。方法:采用MTT比色法、AO/EB双染色法、TUNEL、流式细胞仪、电镜技术等技术分析不同功率的低频超声诱导C6细胞凋亡的作用。⑴MTT比色法检测不同功率的低频超声作用C6细胞后0h、6h、12h、24h和48h等时间点的OD值,计算生长抑制率,初步确定下一步实验所需超声参数;⑵AO/EB双染色法鉴别对照组和辐照各组凋亡/坏死/活C6细胞,并计算细胞凋亡率和坏死率,最终确定实验所需超声参数;⑶TUNEL法观察对照组和辐照组C6细胞的免疫学变化,并计算凋亡指数;⑷流式细胞仪分析对照组和辐照组C6细胞的凋亡率(FITC-Annexin V/PI双染法),细胞周期及APR改变(PI单染法);⑸透射及扫描电镜观察对照组和辐照组C6细胞超微结构的变化。结果:⑴MTT比色法分析可见不同功率低频超声辐照C6细胞后不同时间点细胞增殖均受到抑制,且呈剂量依赖性;由超声辐照后0h、6h、12h、24h、48h时间点的IR值可见:1.75W/cm2组、2.0W/cm2组、2.5W/cm2组辐照后6h对C6细胞增殖抑制作用明显,以下实验均采用超声辐照后6h作为观察点。⑵AO/EB双染色法分析可见对照组仅有极少数早期凋亡细胞,而辐照后各组凋亡细胞明显增加。1.75W/cm2组、2.0W/cm2组、2.5W/cm2组细胞凋亡率分别为17.9±0.65%、13.4±0.94%和12.5±0.67%,细胞坏死率分别为1.3±0.61%、8±0.54%和20±0.63%;⑶TUNEL法分析可见对照组仅有极少量棕黄色染色的凋亡细胞。而辐照组棕黄色染色的凋亡细胞明显增多。与对照组相比较,辐照组的凋亡指数(AI)极显著增加(P<0.01)。⑷流式细胞仪分析可见:与对照组相比较,辐照组的细胞凋亡率增加极显著(P<0.01);对照组细胞在正常二倍体DNA峰前未出现亚二倍体凋亡峰(Ap峰,Apoptotic peak),辐照组细胞则出现一明显的亚二倍体凋亡峰;与对照组相比较,辐照组细胞的凋亡增殖比(APR)极显著上调(P<0.01)。⑸透射及扫描电镜观察可见:透射电镜未见到对照组C6细胞凋亡的超微结构改变,而辐照组C6细胞可见到凋亡各阶段的改变,并可见典型的凋亡小体;扫描电镜显示对照组C6细胞形态结构正常,细胞边界清楚。辐照组C6细胞形态结构正常,细胞膜有穿孔现象。结论:低频低功率超声辐照能抑制C6细胞增殖,并具有剂量依赖性;1.75W/cm2的超声辐照C6细胞后继续培养6h可获得最高的凋亡率和最低的坏死率,是超声诱导C6细胞凋亡的最佳参数,当辐照功率继续增加时,细胞凋亡率未继续增加,而细胞坏死率却明显增加;低功率低频超声能通过阻滞C6细胞于G0-G1期,使进入S期的C6细胞减少来抑制肿瘤细胞的增殖;低频低功率超声可能通过声孔效应引起细胞膜穿孔来诱导细胞凋亡。综上所述,低频低功率超声在肿瘤治疗中具有较好的应用潜力。